Twist与RECK在非小细胞肺癌中的表达及其对预后的影响

作者单位：261042 潍坊医学院（冯凯，吕宾）；山东省潍坊市人民医院（胡德宏，张居民，张振江）

通讯作者：冯凯

【摘要】 目的 通过免疫组化法实验观察Twist和RECK在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达，探讨其在NSCLC中的临床意义及对疾病预后的影响。方法 采用S-P免疫组化法检测60例有完整资料的NSCLC术后肿瘤标本和60例距离肿瘤5 cm以上的正常肺组织中Twist与RECK蛋白的表达情况。通过Kaplan-Meier生存曲线法比较阳性组和阴性组患者的预后情况。结果 在非小细胞肺癌中Twist阳性表达率为65%，显著高于癌旁组织中的8.3%；RECK阳性表达率为51.7%，低于癌旁组织中的85%。Twist在非小细胞肺癌组织中的阳性表达与肿瘤的TNM分期、原发肿瘤大小、淋巴结转移情况及2年无瘤生存率有显著的相关性（P＜0.05）。RECK在非小细胞肺癌组织中的表达与肿瘤TNM分期、原发肿瘤大小、淋巴结转移情况及2年无瘤生存率存在相关性（P＜0.05），而两者与其他病理因素无关（P＞0.05）。Twist与RECK在非小细胞肺癌组织中的表达具有相关性（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存曲线分析显示患者术后2年无瘤生存率随Twist阳性表达呈现下降趋势，而随RECK阳性表达显著上升。结论 Twist、RECK可能在NSCLC的浸润、转移中存在相互作用，可作为反映NSCLC进展的重要生物学指标。Twist高表达、RECK低表达的患者易发生淋巴结转移，预后较差，术后2年无瘤生存率较低。

【关键词】 Twist； RECK； NSCLC； 预后； 免疫组织化学

Expressions of twist and rECK in non-small cell lung cancer tissues and their effects on prognosis FENG Kai,HU De-hong,ZHANG Ju-min,ZHANG Zhen-jiang,LV Bin. Weifang medical college, Weifang 261042,China

【Abstract】 Objective To observe the expressions of Twist and RECK in non-small cell lung cancer （NSCLC） and discuss their clinical significance and effects on disease prognosis through the immunohistochemical method experiment.Methods With the S-P Immunohistochemical method,the Twist and RECK protein expressions were detected in both 60 cases of NSCLC postoperative tumor specimens with complete information and another 60 cases of normal lung tissue with a distance of at least 5 cm from the tumor. It also made a comparison of the prognosis between the positive and negative patient groups through the Kaplan-Meier survival curve method.Results It showed that the positive expression rate of Twist in NSCLC （65%） was significantly higher than that in paracancerous normal tissues （8.3%）,while the positive expression rate of RECK in NSCLC （51.7%） was lower than those in paracancerous normal tissues （85%）.The former had remarkable relation to the tumor differentiation, the depth of invasion, lymph node metastasis, the TNM stage and the 2 years"disease-free survival（P<0.05）, and the latter to the depth of invasion, lymph node metastasis, TNM stage and the 2 years"disease-free survival（P<0.05）. However, neither of them was related to any other pathological factors（P>0.05）. Besides,the expression of Twist in NSCLC and that of RECK was obviously related（P<0.05）.The analysis of Kaplan-Meier survival curve presented the declining tendency of disease-free survival rate of patients two years after treatment along with Twist expression and its increasing tendency along with RECK expression.Conclusion The expressions of Twist and RECK may play a cooperative role in the infiltration and metastasis of NSCLC, which may also serve as important biological parameters for judging the NSCLC progression. Patients with up-regulated expression of Twist and down-regulated expression of RECK were prone to have lymph node metastasis, poor prognosis and lower disease-free survival rate 2 years after operation.

【Key words】 Twist; RECK; NSCLC; Prognosis; Immunohistochemical

肺癌是人体最常见的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌是肺癌最常见的组织类型，肿瘤细胞的转移和侵袭是影响肺癌预后的重要因素，它是一个多步骤、多阶段发生及多基因参与调控的过程，也是临床上肺癌治疗效果不佳的关键因素^［1］。Twist能通过对细胞凋亡的抑制，参与肿瘤细胞周期调控，并通过调节肿瘤细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）促进肿瘤侵袭转移，表现出癌基因的特点。RECK（reversion-inducing cysteine-rich protein KaZal motif）基因是日本学者Takahashi等发现的一种新的肿瘤抑制基因。其功能独特性表现在抑制基质金属蛋白酶表达与活性，同时RECK也具有较好抑制血管生成和成熟功能^［2］。关于NSCLC中Twist与RECK联合表达与肿瘤转移之间的关系，国内外鲜有此类报道。笔者通过免疫组化S-P法检测两者在非小细胞肺癌及正常肺组织中表达的差异及相关性，进一步探讨两者在NSCLC的侵袭、转移中的作用和机制，以期寻找NSCLC早期诊断和判断预后的分子指标，为肺癌的预后判断提供客观的依据，并可能为今后NSCLC的治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 选择2008年1月～2009年6月潍坊市人民医院胸外科住院治疗的NSCLC患者肿瘤标本60例作为实验组，另取60例距离肿瘤5 cm以上的正常肺组织作为对照组。其中男45例，女15例，年龄30～76岁，中位年龄56岁，术前均未接受放化疗。按照WHO肺癌分型标准及UICC（2009年）新的国际肺癌分期标准进行分型、分期，其中腺癌24例，鳞癌36例；Ⅰ期6例，Ⅱ期34例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例。所应用试验标本采用10%的福尔马林固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.2 病例随访 以电话、信件等形式对60例肺癌手术患者进行随访，随访资料完整，无瘤生存期的计算从手术日期到随访截止日期（2011年6月），或出现肿瘤复发、转移、死亡的日期为止。到随访截止日有2例失访，有40例存活（其中4例出现复发），18例死亡（其中16例因肿瘤复发死亡，2例因意外死亡）。

1.3 免疫组化方法检测Twist及RECK的表达，采用SP法，Twist和RECK兔抗人单克隆抗体均购自北京博奥森公司，Twist单克隆抗体（1∶150稀释），RECK单克隆抗体（1∶100稀释），染色步骤按说明书进行。

1.4 结果判定 RECK、Twist的阳性染色模式均为细胞浆着色，呈浅黄色至棕黄色颗粒。选具有代表性的10个高倍视野进行观察计数，每个视野计数100个肿瘤细胞。在肿瘤细胞膜和（或）细胞质有黄棕色或玫瑰红色颗粒沉着为RECK及Twist阳性染色。根据染色程度和染色细胞百分率进行评分，基本不着色为0分，着色淡为1分，着色适中为2分，着色深为3分；着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。将每张切片平均着色程度得分与平均着色细胞百分率得分各自相乘为其最后得分：1分为阴性（-），2～3分为（+），4～6分为（++），＞6分为（+++）。弱阳性表达指（+），强阳性表达指≥（++）。

1.5 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率表示，不同组间比较行χ²检验，生存率的组间比较采用Kaplan-Meier生存曲线法及Log-rank检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Twist和RECK蛋白表达的免疫组织化学检测结果 Twist和RECK在癌旁正常肺组织中阳性表达分别为8.3%（5/60）和85%（51/60）；在NSCLC组织中两者的阳性表达率分别为65%（39/60）和51.7%（31/60），阳性着色部位均为细胞质，少数伴有细胞膜染色，经比较，Twist及RECK蛋白在NSCLC组织和癌旁正常肺组织中的表达差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1、表2和图1、图2。

表1 Twist在非小细胞肺癌及癌旁正常组织中的表达

表2 RECK在非小细胞肺癌及癌旁正常组织中的表达

2.2 Twist、RECK在NSCLC组织中表达与临床病理特征的关系 NSCLC组织中Twist、RECK表达均与临床分期、原发肿瘤大小、淋巴结转移情况及2年无瘤生存率密切有关（P＜0.05）；但与组织学分型、性别和分化程度无关（P＞0.05），见表3。

2.3 Twist、RECK在NSCLC组织中表达与淋巴结转移情况之间的关系 将Twist与RECK表达状况分为亚组，观察其与淋巴结转移的关系，发现Twist蛋白表达阳性及RECK阴性表达的NSCLC患者18例（30%），有淋巴结转移者占77.78%（14/18）。该组患者淋巴结转移率明显高于其他亚组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表3 非小细胞肺癌Twist和RECK的表达与病理参数的关系

表4 NSCLC组织中Twist、RECK表达与淋巴结转移

情况之间的关系

2.4 Twist、RECK在NSCLC组织中表达与患者术后2无瘤生存期的关系 本组患者有2例失访，2例术后出现意外死亡，进行Kaplan-Meier生存曲线分析，结果显示2年无瘤生存率Twist表达（-）组为80.0%，Twist表达（+）组为59.0%，全组中位无瘤生存期未达及，原因考虑为样本量较小及随访时间较短造成。结果表明，患者术后生存期跟Twist的表达情况有相关趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。RECK表达（-）组患者2年无瘤生存率50.2%，中位无瘤生存时间为25.0月；RECK表达（+）组为82.6%，中位无瘤生存时间为39.0月，提示患者术后生存期随RECK的阳性表达显著上升，Log-rank检验结果显示差异有统计学意义（P＜0.05），见图3、图4。

2.5 Twist与RECK在NSCLC中表达的相关性 运用Spearman等级相关检验发现，60例非小细胞肺癌组织中Twist与RECK的表达成负相关（r-0.652，P＜0.05），见表5。

表5 Twist与RECK在NSCLC中表达的相关性

3 讨论

Twist蛋白属于碱性的螺旋-环-螺旋蛋白家族中的高度保守的转录因子，正常情况下主要表达于胎盘、胚胎中胚层和成人的某些中胚层来源的未分化组织，上皮-间叶变过程中一个重要的调节因子，上皮-间叶变（epithelial mesenchymal transition,EMT）是肿瘤发生、发展的重要环节，肿瘤细胞出现EMT被认为是肿瘤转移开始的标志^［3］，E-boxes启动子的表达被Twist转录因子在转录水平上抑制，诱导EMT的形成，E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达被抑制，使E-cadherin介导的细胞-细胞黏附功能丧失或消弱，恶性肿瘤细胞因此便容易从原发灶脱离向周围其他组织侵袭，为恶性肿瘤的转移提供必要条件^［4］。Twist已经被证明作用于多种恶性肿瘤细胞的发生及浸润转移过程中，Horikawa等^［5］研究发现在转移性鼻咽癌中，Twist介导上皮间质化进而促进肿瘤的转移。Zhang等^［6］发现Twist高表达在膀胱癌的进展中起重要作用，并与膀胱癌的分期具有相关性。Yang等^［7］对小鼠乳腺癌细胞株体内和体外的系列实验研究表明，Twist在恶性肿瘤转移阶段表达明显增强，应用RNA干扰技术后肿瘤细胞的存活时间和生长速率都显著下降。本研究通过免疫组化法定性检测分析NSCLC及癌旁组织中Twist的表达，证实Twist在NSCLC中阳性率为65%，对照组阳性率为8.3%，差异有统计学有意义（P＜0.05），结果说明Twist在NSCLC的发生、发展过程中可能发挥一定的作用。结果同时也证实Twist的表达与淋巴结转移、分化程度、临床分期、2年无瘤生存率密切相关（P＜0.05），因此，Twist在NSCLC组织中阳性表达水平的高低提示患者的预后。

1998年Takallashi等成功地从大鼠纤维母细胞株NIH3T3中克隆出转移抑制基因，命名为RECK。RECK基因定位于人染色体9p12-13，整个基因的长度约87 kb，含有21个外显子和20个内含子，是一种新发现的MMPs抑制剂。它能在转录后水平抑制至少3种MMPs，即MMP-2、MMP-9及MTI-MMP。MMPs通过降解血管周围细胞外基质，调节和释放血管活性因子，从而促进肿瘤新生血管形成。有研究发现，表达RECK的肿瘤组织血管新生受抑，微血管密度明显下降，血管腔变粗大，尽管大血管周围的部分肿瘤细胞能够生存，但血管外周的大部分肿瘤细胞缺血坏死^［8］。这样可以认为，RECK基因通过抑制MMPs酶活性与肿瘤血管生成两方面抑制肿瘤侵袭和转移。RECK作为一个独立因素，与肝癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌等的预后密切相关，肿瘤组织中RECK表达阳性的患者预后均好于表达阴性的患者^［9～11］。本实验结果表明：RECK蛋白在NSCLC组织中的阳性率为51.7%，在正常肺组织中的阳性率为85%，差异有统计学意义（P＜0.05），本研究证实随着病变向晚期进展，RECK表达水平逐渐下降，出现淋巴结转移者逐渐增多，2年无瘤生存率逐渐下降（P＜0.05）。因此，可以通过对RECK表达水平的检测来预测患者预后。

Twist与RECK的表达可能在非小细胞肺癌的发生、发展和浸润转移过程中起重要作用，通过统计学数据分析表明，两者成负相关关系，但两者之间的具体相互作用机制还需进一步探讨。如能进一步通过实验证实在NSCLC患者外周血中能够检测到这两种因子，并完善相关的检测手段，有可能成为临床上非小细胞肺癌患者早期诊断及预测预后的一种分子标记物。另外，研制能够上调癌细胞中的RECK表达或者下调Twist表达的药物，或通过基因治疗使RECK低表达或者不表达的癌细胞中的RECK正常表达，对阻止肿瘤浸润转移具有重要的意义，从而为非小细胞肺癌的治疗开辟新的途径。

参 考 文 献

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（收稿日期：2011-07-27）

（本文编辑：陈丹云）