胶体金免疫层析试纸法检测农产品中戊唑醇残留

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摘 要 利用纳米金标记高亲和、高特异性戊唑醇单克隆抗体，建立了戊唑醇免疫层析快速检测方法，通过裸眼观察可快速定性判断是否超过最大限量值（MRL），实现了样品现场快速筛查与精准定量分析，具有快速、精准、低成本的优点。以20 nm的胶体金颗粒标记抗戊唑醇单克隆抗体作为检测探针，分别将包被原Teb-OVA（0.3 mg/mL）和羊抗小鼠IgG抗体（1 mg/mL）包被于硝酸纤维膜（NC膜）， 形成检测线（T线）和质控线（C线），组装成的胶体金免疫层析检测试纸条裸眼观察的检出限为6.25 ng/mL（T线完全消线），可在15 min内实现小麦、黄瓜和甘蓝中戊唑醇的定性与半定量分析，分析结果与高效液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）方法的检测结果一致。胶体金免疫检测方法特异性和准确性好，操作方便，重复性好，可满足现场快速筛查大量样品的需求。

关键词 戊唑醇残留; 胶体金免疫层析; 液相色谱串联质谱

1 引 言

戊唑醇（Tebuconazole， 1-（4-氯苯基）-3-（1H-1，2，4-三唑-1-基甲基）-4，4-二甲基戊-3-醇）是一种三唑类杀菌剂，能有效防治由白粉菌属、柄锈菌属、喙孢属、核腔菌属和壳针孢属引起的病害，广泛用于小麦、蔬菜、香蕉、苹果等作物的种子处理和叶面防治[1～5]，是三唑类杀菌剂中使用量与销售最高的品种之一[6]，防治谱广，使用广泛。但戊唑醇对哺乳动物具有毒性，且在肝脏和血液中有毒性蓄积作用，具有潜在的非遗传致癌毒性作用及环境激素内分泌干扰效应[7～9]。美国环保署（EPA）已将三唑类杀菌剂中的戊唑醇、烯效唑、己唑醇、丙环唑和氟环唑列入潜在的人类致癌物名单[10]，欧盟委员会和我国规定了部分农作物和蔬菜中戊唑醇的最大残留限量（0.05 mg/kg）[11，12]。因此，研发快速、精准的戊唑醇残留分析方法，是进行有效监管的重要环节。

戊唑醇残留的仪器检测方法包括气相色谱法（氮磷检测器，GC-NPD）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、高效液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）和毛细管气相色谱法等。Dong等[13]采用LC-MS/MS测定戊唑醇及其代谢产物在土壤、葡萄中的残留动态与风险评估，方法的检出限为0.1 mg/kg。 Zhang等[14]建立了HPLC方法对土壤沉积物中的戊唑醇等3种手性三唑类杀菌剂的同分异构体的降解情况进行研究，手性化合物的消长分布符合一级动力学方程，且与沉积物的性质相关联。Wang等[15]建立了固相萃取-超高效液相/串联质谱法检测水中戊唑醇残留，不同基质检出限为0.001～41.27 ng/L，回收率为76%～97%。刘军等[16]采用分散固相萃取-液相色谱-质谱法测定水稻及土壤中戊唑醇残留量，检测范围为5～200 μg/L，检出限为2.5 ×10-11 g。

免疫分析技术广泛用于现场检测和高通量筛选，具有简单、便携、快速、低成本等优点，是仪器分析方法的补充[17]，包括酶联免疫吸附分析（ELISA）、免疫层析试纸条和免疫传感器等[18～21]。其中以纳米金作为信号输出的胶体金试纸条实用性强， 操作简单， 裸眼即可判定结果，应用广泛。目前，对戊唑醇的免疫分析报道不多，主要是由于不易获得高质量抗体，其中基于胶体金试纸条的残留检测方法未见报道。Danks 等[22]报道了基于多克隆抗体的ELISA方法，对戊唑醇的检测范围为0.02～20 mg/L; Qi等[23]利用分子印迹电化学传感器等方法（ECA），通过信号的放大作用实现对戊唑醇的检测，灵敏度达到3.85 ng/mL; Chen等[24]通过设计半抗原获得特异性抗体，建立的免疫分析方法对水样中的戊唑醇的检测灵敏度为0.197～0.297 ng/mL。本研究以前期设计的新型半抗原制备的抗戊唑醇的高特异性、高亲和力单克隆抗体为材料，建立了半定量胶体金免疫层析试纸条分析方法，实现裸眼观察确定戊唑醇残留，经ELISA鉴定此抗体对戊唑醇的检测灵敏度为0.07 ng/mL（IC20），IC50为 0.19 ng/mL[25]; 同时，建立了基于LC/MS-MS的检测方法，以小麦、黄瓜和甘蓝等样品为对象，进行了方法的验证，表明两种检测方法配合使用可以实现对戊唑醇的精准、快速检测，优势互补。其中，免疫层析试纸快速、方便，能用于现场检测，LC-MS/MS方法准确、灵敏，可用于大量样品的高通量定量检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

XYZ3050TM试纸条喷膜仪（Bio-Dot公司）; ZQ2000微电脑试纸条自动切割仪（上海金标生物科技有限公司）; Lambda25 UV-vis Spectrometer双光束紫外-可见分光光度计（美国Perkin Elmer公司）; Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜-质谱联用仪（美国Agilent公司）; Multiscan ascent 酶标仪（美国Thermo公司）; H-7650透射电子显微镜（日本日立公司）; 硝酸纤维素膜（NC膜）、金标结合垫、吸水垫（美国Millipore公司）; 聚氯乙烯（PVC）底板、样品垫（上海金标科技生物有限公司）; 超纯水净化仪（美国Labconco公司）。

戊唑醇标准品（农业部环境质量监督检验测试中心（天津））; 戊唑醇单克隆抗体（Teb McAb）及半抗原、包被原（Teb-OVA）由本实验室制备。羊抗小鼠IgG（武汉博士德生物工程有限公司）; 牛血清蛋白（BSA）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）、二水合柠檬酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）（美国Sigma公司）; 其它试剂均为分析纯（西陇化工股份有限公司）。小麦粉产于江苏省农业科学院试验田，甘蓝、黄瓜购于南京某超市。

2.2 抗原的制备

2.2.1 半抗原的合成 戊唑醇半抗原的合成如图1所示， 以C5H10COOH基团取代戊唑醇苯环上的p-Cl，引入偶联臂和活性COOH基团，合成半抗原。