L-精氨酸对病理性心肌肥大抑制作用的研究

[摘要] 目的 观察L-精氨酸对心肌肥厚的保护作用及相关机制。 方法 雄性Wistar大鼠36只，随机分为3组，每组各12只：对照组、模型组（ISO组）、L-精氨酸治疗组。皮下注射异丙肾上腺素（ISO）复制大鼠心肌肥厚模型，检测心脏重量参数（心重/体重，左室重/体重），心肌组织胶原含量，心房利钠肽（ANP）的转录水平，观察L-精氨酸对心肌肥大的影响；检测各组大鼠血清一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、丙二醛（MDA）和乳酸脱氢酶（LDH）含量。 结果 L-精氨酸治疗组心重/体重[（3.52±0.21）mg/g]和左室重/体重[（2.39±0.23）mg/g]均低于ISO组[心重/体重（3.89±0.25）mg/g，左室重/体重（2.67±0.26）mg/g）]，差异有统计学意义（P < 0.05）。同时，L-精氨酸治疗组ANP mRNA表达相对值（1.2）低于ISO组（1.5），差异有统计学意义（P < 0.05）；心肌间质胶原含量，L-精氨酸治疗组[（14.52±3.09）%]低于ISO组[（35.24±4.78）%]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；L-精氨酸治疗组NO含量[（34.15±6.12）μmol/L]和NOS活性[（23.9±3.12）U/mL]与ISO组NO含量[（20.96±5.06）μmol/L]和NOS活性[（16.58±3.12）U/mL]比较均增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；L-精氨酸治疗组MDA水平[（308.73±37.48）nmol/L]和LDH水平[（2065.35±347.46）U/L]与ISO组MDA含量[（389.63±42.85）nmol/L]和LDH水平[（3582.89±364.51）U/L）]比较均降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 早期给予L-精氨酸可以通过增加NO含量，减少MDA和LDH水平，减少心肌间质胶原沉积进而抑制病理性心肌肥大。

[关键词] 心肌肥厚；L-精氨酸；一氧化氮

[中图分类号] R364.31[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）05（a）-0015-04

Research of inhibitory effects of L-arginine on pathological cardiac hypertrophy

SHEN Yunhong1 XIAO Wei2 JIN Li2 ZHANG Xiangguo2 LIN Yan2

1.Functional Laboratory, Qiqihar Medical University, Heilongjiang Province, Qiqihar 161006, China;2.Department of Pathophysiology, Qiqihar Medical University, Heilongjiang Province, Qiqihar 161006, China

[Abstract] Objective To explore the role and the related mechanisms of L-arginine on pathological cardiac hypertrophy. Methods Male adult Wistar rats were randomized to three groups , control group (12 rats), ISO group (12 rats) and L-arginine group (12 rats). Hypertrophic model of rats was established by isoproterenol (ISO). Pretreated with L-arginine, hypertrophy status of rats were determined by hypertrophy coefficient, collagen content and the expression of ANP mRNA. The activity and level of nitric oxide (NO), nitric oxide synthase (NOS), malonic dialdehyde (MDA) and lactate dehydrogenase (LDH) in serum were observed. Results L-arginine decreased the parameter of ventricular mass, heart weight/body weight [(3.52±0.21) mg/g] and left ventricular weight/body weight [(2.39±0.23) mg/g] in L-arginine group were lower than those in ISO group [heart weight/body weight (3.89±0.25) mg/g, left ventricular weight/body weight (2.67±0.26) mg/g], the differences were statistically significant (P < 0.05). Meanwhile, the relative ratio of the ANP mRNA expression in L-arginine group (1.2) was lower than that in ISO group (1.5), the difference was statistically significant (P < 0.05); the myocardial interstitial collagen content of L-arginine group [(14.52±3.09)%] was lower that of than ISO group [(35.24±4.78)%], the difference was statistically significant (P < 0.01); the NO content [(34.15±6.12) μmol/L] and NOS activity [(23.9±3.12) U/mL] of L-arginine increased than those of ISO group [(NO content (20.96±5.06) μmol/L, NOS activity (16.58±3.12)U/mL], the differences were statistically significant (P < 0.01), at the same time, the MDA content [(308.73±37.48) nmol/L] and LDH level [(2065.35±347.46) U/L] of L-arginine group were decreased than those of ISO group [MDA content (389.63±42.85) nmol/L, LDH level (3582.89±364.51) U/L], the differences were statistically significant (P < 0.05 or P< 0.01). Conclusion Exogenous L-arginine can inhibit cardiac hypertrophy through increasing NO and NOS level, decreasing the level of MDA and LDH, and decreasing myocardial interstitial collagen content.

[Key words] Cardiac hypertrophy; L-arginine; Nitric oxide

心肌肥大是高血压常见的并发症，心力衰竭发生的结构基础，也是心律失常等多种心血管疾病的独立危险因素。一氧化氮（NO）是多种细胞均可以产生的自由基，在全身各处广泛存在。作为NO的前体L-精氨酸可通过拮抗氧自由基、增加心肌组织能量代谢、增加冠脉血流量和抑制中性粒细胞聚集等对心血管系统发挥保护作用[1]。本研究的主要目的是研究L-精氨酸干预对心肌肥大和细胞损伤的影响，及NO和一氧化氮合酶（NOS）的变化，以探讨L-精氨酸对心肌肥大的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性Wistar大鼠36只，体重（200±20）g，齐齐哈尔医学院动物中心提供。平衡饮食一周后，将大鼠随机分3组，每组各12只：①对照组：给予0.9％氯化钠注射液[5 mL/（kg·d）]皮下注射；②模型组（ISO组）：ISO皮下注射5 mL/（kg·d），连续7 d；③L-精氨酸治疗组：ISO皮下注射5 mL/（kg·d）的同时给予L-精氨酸800 mg/（kg·d），腹腔注射，常规给水，连续给药7 d[2-3]。

1.2 试剂与设备

L-精氨酸，异丙肾上腺素（ISO）购于美国Sigma公司，Trizol和逆转录试剂盒购于Takala公司，Leica切片机，Leica显微镜，电子天平；紫外-可见分光光度计（岛津），乳酸脱氢酶（LDH)、丙二醛（MDA)、NO和NOS检测试剂盒购于南京建成生物公司。

1.3 样本采集

末次给药后次日，称量大鼠体重（BW）后，2％乌拉坦腹腔注射麻醉后，取心脏组织，称全心重（HW）和左室重（LVW），立即投入液氮中保存。

1.4 胶原纤维染色

取心肌组织左室游离壁，10％甲醛固定，石蜡包埋，常规HE和胶原纤维染色（VG）。图像分析系统分析心肌间质胶原含量。

1.5 生化指标检测

剥离左侧颈总动脉，取血。4℃，3000 r/min离心后取上清。用NO、NOS、MDA和LDH试剂盒测定血清中相应酶的活性或含量。步骤完全按照试剂盒说明操作。

1.6 RT-PCR反应检测大鼠心肌组织ANP基因表达

RT-PCR按TRIzol试剂盒说明书抽提心肌组织总RNA，紫外测定OD260/OD280的比值。参照Takala公司说明书将RNA逆转录成cDNA，以合成好的cDNA为模板进行PCR扩增反应。ANP上游引物：5"-GGCTCCTTCTECATGACCAA-3"；下游引物：5"-TGTTATCTTEGGTACCG-3"；产物长度458 bp。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离，并应用凝胶成像系统分析，以目的片段ANP带的灰度与内参照β-actin带的灰度之比表示ANP mRNA的表达水平。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验；重复测量的计量资料多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心脏重量参数的变化

大鼠心肌重量参数即心重（左室重）与体重的比值可作为评价大鼠心肌肥大的指标。ISO组与对照组比较，ISO诱导大鼠心肌重量参数增加显著，心重/体重比值为（3.89±0.25）mg/g，左室重/体重比值为（2.67±0.26）mg/g，均明显高于对照组[心重/体重比值（3.39±0.25）mg/g，左室重/体重比值（2.33±0.11）mg/g]，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。见图1。

L-精氨酸治疗组与ISO组比较，L-精氨酸可抑制心肌重量参数，L-精氨酸治疗后，心重/体重比值（3.52±0.21）mg/g和左室重/体重比值（2.39 ±0.23）mg/g均低于ISO组 （P < 0.05）。

注：与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与ISO组比较，#P < 0.05；HW：心重；BW：体重；LVW：左室重

图1 L-精氨酸对心肌重量参数的影响

2.2 心肌组织ANP mRNA表达水平的变化

ISO组与对照组比较，ISO组心肌组织ANP基因的表达水平相对值（1.5）明显高于对照组（1.0），差异有高度统计学意义（P < 0.01）；L-精氨酸治疗组与ISO组比较，L-精氨酸治疗组ANP基因表达水平相对值（1.2）低于ISO组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

B

注：A：ANP基因表达电泳图；B：各组ANP基因水平相对值图；与对照组比较，**P < 0.01；与ISO组比较，#P < 0.05

图2 ANP基因表达电泳与各组ANP基因水平相对值

2.3 心组织胶原含量的变化

心肌组织经Van Gieson染色后，光镜下见心肌细胞呈橘黄色，间质胶原纤维呈红色。病理图像分析系统分析显示，ISO组与对照组比较，ISO组心肌组织间质胶原含量[（35.24±4.78）%]明显高于对照组[（7.02±2.13）%]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；L-精氨酸治疗组与ISO组比较，胶原含量[（14.52±3.09）%]低于ISO组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图3。

注：与对照组比较，**P < 0.01；与ISO组比较，##P < 0.01

图3 L-精氨酸对心肌间质胶原含量的影响

2.4 L-精氨酸干预对心肌组织 NO、NOS、MDA 和LDH水平的影响

ISO组NO含量[（20.96±5.06）μmol/L] 和NOS活性[（16.58±3.12）U/mL]与对照组[NO含量（36.72±5.32）μmol/L，NOS活性（24.96±3.59）U/mL]比较，明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图4。

ISO组MDA含量[（389.63±42.85）nmol/L]和LDH水平[（3582.89±364.51）U/L]与对照组[MDA含量（240.72±26.63）nmol/L，LDH水平（1328.62±206.35）U/L]比较显著增加，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。与ISO组比较，L-精氨酸治疗组NO含量[（34.15±6.12）μmol/L]和NOS水平[（23.99±3.12）U/mL]均增加，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05），MDA水平[（308.73±37.48）nmol/L]和LDH水平[（2065.35±347.46）U/L]均降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图5。

注：与对照组比较，*P < 0.05，*P < 0.01；与组虽ISO组比较，#P < 0.05，##P < 0.05；NO：一氧化氮；NOS：一氧化氮合酶

图4 L-精氨酸对血清NO含量和NOS活性的影响

注：与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与ISO组比较，#P < 0.05，##P < 0.01

图5 L-精氨酸对血清丙二醛含量和乳酸脱氢酶活性的影响

3 讨论

心肌肥大既是压力负荷增加时心肌组织代偿性增生的结果，又是高血压、心律失常、心力衰竭等心血管疾病的独立危险因素。严重影响患者的预后，并增加死亡率[4]。因此，探讨心肌肥大的发病机制，寻找有效的防治措施，具有重要的临床意义。

ISO通过激活β-肾上腺素受体诱导的心肌肥大，被认为是研究心肌肥厚的重要模型[5]。ISO皮下注射7 d后，心脏重量参数明显增加，ANP基因表达增高，同时心肌间质胶原增加，这些均表明心肌肥大模型复制成功。LDH是催化L-乳酸与丙酮酸之间可逆反应的脱氢酶。广泛存在于心肌、肝、骨骼肌、肺等各种组织中。当心肌细胞受到损伤时，LDH等心肌酶从胞浆中漏出，测定血清和组织中LDH活性可反映心肌损伤程度，并已成为反映心肌损伤程度的敏感指标被广泛采用。MDA对心肌的毒性损伤主要与氧自由基损伤、钙超载、细胞凋亡、ADM继发代谢产物等有关。二者联合可反映心肌组织损伤程度。实验结果显示，ISO诱导心肌肥大的同时，增强了血清中LDH活性和MDA含量，表明ISO诱导心肌肥大的同时，引发心肌组织强烈的脂质过氧化反应，产生大量的自由基，严重损伤心肌组织。

近年，L-精氨酸对心肌疾病的作用研究开展较多，有助于进一步解释心肌疾病的机制，寻找新的治疗靶点。L-精氨酸在NOS的作用下，生成NO和L-瓜氨酸，即L-精氨酸—NO通路。目前认为L-精氨酸—NO通路所产生的NO主要通过自分泌和（或）旁分泌的方式发挥其生理效应。目前研究表明，NO供体具有减轻缺血再灌注引起的心肌细胞损伤和减轻腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚的作用[6-7]。本研究结果表明，L-精氨酸干预后明显降低心脏重量参数和ANP基因表达水平，同时又减少心肌间质胶原含量，对心肌肥大有明显的抑制作用。同时发现，心肌肥大时，NOS活性和NO含量均降低，L-精氨酸干预后，显著逆转了上述改变。在生理情况下，心肌中可以表达内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和神经元型一氧化氮合酶（nNOS），二者以精氨酸为底物生成NO，参与心肌收缩的调整。不同亚型的NOS在心肌中的位置不同，从而对心肌的收缩产生不同的影响[8-9]。Ganzinelli等[10]研究表明NO弥散进入细胞核后，影响c-fos，c-myc相关基因转录水平，进而抑制心肌肥大。与对照组比较，ISO增强了LDH活性和MDA含量。L-Arg显著降低MDA含量和LDH活性。推测L-精氨酸通过促进NO的产生，减少过氧亚硝酸阴离子（ONOO－）生成，直接中和氧自由基，消除氧自由基对心肌的损害，并增强膜稳定，从而减轻细胞损伤。

综上所述，L-精氨酸干预，通过激活L-精氨酸—NO通路，促进体内NO浓度增加，可减轻心肌肥大和保护心肌细胞。随着今后的深入研究，将为L-精氨酸的临床应用提供广阔前景。

[参考文献]

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[10]Ganzinelli S，Joensen L，Borda E，et al. Mechanisms involved in the regulation of mRNA for M2 muscarinic acetylcholine receptors and endothelial and neuronal NO synthases in rat atria [J]. Br J Pharmacol，2007，151（2）：175-185.

（收稿日期：2014-01-28本文编辑：苏畅）

[基金项目] 黑龙江省教育厅科学技术研究项目（编号1252 1617）。

[通讯作者] 林岩（1975-），女，博士，教授；研究方向：心血管疾病发病机制。