黑木耳凝集素的提取工艺

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摘要：以黑木耳为原料，采用磷酸缓冲液浸提，在料液比、浸提时间、浸提温度等单因素试验的基础上，设计正交试验，以研究黑木耳凝集素的最佳提取工艺。结果表明，以磷酸盐缓冲液为提取剂，料液比1 g ∶15 mL，提取温度为 30 ℃，提取时间为16 h条件下，黑木耳凝集素的凝集活性最高，达到0.742。

关键词：黑木耳；凝集素；提取工艺；凝集活性

中图分类号： S646.601；R284.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0259-02

黑木耳（Auricularia auricula）营养丰富，是我国传统的食药兼用菌，含有多糖、凝集素、三萜类等药用成分，具有提高免疫功能、抗癌、降血脂等功效。随着双孢菇、灵芝、金针菇和口蘑等真菌凝集素及抗肿瘤效果的发现，真菌凝集素的作用被逐渐认识，它具有凝集细胞、活化淋巴细胞、免疫调节、抑制癌细胞、抑制植物病原真菌等作用[1-3]。我国是黑木耳的生产和消费大国，研究黑木耳中包括凝集素在内的多种活性成分的提取工艺，对黑木耳的开发和利用具有重要意义。本研究利用磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）浸提法，采用正交试验，优化提取工艺条件，以期为黑木耳凝集素在食品、医药、保健方面的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑木耳干品从市场购买，经粉碎、筛分、密封后存放于阴凉处备用。鸡血由武汉生物工程学院基础生物学实验室提供。试验所需试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 黑木耳凝集素的提取方法 取黑木耳干品粉末2.5 g，选取合适的提取试剂，以料液比1 g ∶20 mL在4 ℃条件浸提过夜。浸提液经过滤，4 000 r/min冷冻离心30 min。上清液加入固体硫酸铵至饱和度为50%，4 ℃盐析12 h。沉淀经冷冻离心、透析后，用PBS溶解，获得凝集素粗品。

1.2.2 凝集活性的测定 采用孙册等的方法[4]，检测凝集效价，即凝集素倍比稀释后，加入等量的2%鸡红细胞悬液，静置1 h观察结果。根据红细胞凝集分类标准，判定红细胞凝集效价[5]。参照赵则海等的方法[6]，对凝集效价定性数据赋值，取其加权平均数作为量化的凝集活性（agglutinating activity，Aa）。以凝集活性为指标，筛选提取的最佳工艺。

1.2.3 提取剂的选择 分别以PBS（0.05 mol/L，pH值7.2）、0.9%NaCl、蒸馏水作为提取剂，提取黑木耳凝集素，血凝法检测凝集效价和凝集活性，确定最佳提取试剂。

1.2.4 单因素试验 以黑木耳凝集素的凝集活性为指标，以PBS为提取试剂进行单因素试验。料液比分别为 1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL；提取温度分别为4、20、30、40 ℃；提取时间分别为6、12、18、24 h，确定各因素对试验的影响。

1.2.5 正交试验设计 选取料液比、提取温度、提取时间3个因素，以凝集活性为指标，进行L9（33）正交试验，试验设计见表1，对黑木耳凝集素的提取最佳工艺进行研究 [7-8]。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对黑木耳凝集素凝集活性的影响 由图2可知，随着提取剂PBS用量的增大，提取的凝集素凝集活性也增大，料液比1 g ∶15 mL时，凝集活性基本达到最高；此后随着提取剂用量的增加，凝集素凝集活性有下降的趋势。提取剂用量少会导致提取率低和提取液黏稠，而用量过多会使提取液浓缩工作的负荷增加，因此确定最佳料液比为 1 g ∶15 mL。

2.2.2 提取温度对黑木耳凝集素凝集活性的影响 由图3可知，在4～30 ℃，黑木耳凝集素的凝集活性随温度升高而增加，30 ℃时达到最高；温度超过30 ℃时，凝集活性明显下降。结果表明黑木耳凝集素对温度比较敏感，提取温度过高可能导致凝集素变性失活，凝集活性下降，因此提取温度应选择30 ℃。

2.2.3 提取时间对黑木耳凝集素凝集活性的影响 由图4可知，提取时间在12 h以内，黑木耳凝集素的凝集活性随着提取时间的延长而增加，12 h时达到峰值；此后，随着提取时间的延长，凝集素的凝集活性缓慢下降。综合考虑凝集素的提取率、凝集活性以及提取进度，确定提取时间为12 h。

2.3 正交试验

正交试验结果和极差分析见表2，方差分析结果见表3。影响黑木耳凝集素提取因素的主要顺序为：提取时间（C）>提取温度（B）>料液比（A）。由表3可知，因素C有显著差异，说明提取时间对凝集素凝集活性的影响最明显；因素A、B没有显著差异，对凝集素凝集活性没有显著性影响。结合极差和方差分析、单因素试验，确定黑木耳凝集素提取的最佳工艺参数是A1B2C3，即提取温度30 ℃、料液比1 g ∶15 mL，浸提时间16 h。此组合没有出现在正交表中，经过3次验证试验后，提取的凝集素的凝集活性平均为0.742，大于正交组合中的任一组合。

3 结论与讨论

本试验以单因素试验和正交试验相结合，对黑木耳凝集素提取工艺条件进行优化，得到最佳提取工艺为：以PBS为提取剂，料液比1 g ∶15 mL，提取温度30 ℃，提取时间为 16 h，经饱和度50%的硫酸铵盐析、透析后，获得的黑木耳凝集素的凝集活性达到0.742。

本试验以凝集素的凝集活性为指标，考察不同因素对提取的影响。在血凝法试验中，如何确定凝集素提取液的凝集效价比较困难。相比较其他方法，通过对凝集效价加权平均数获得量化的凝集活性，在凝集素提取及凝集活性研究中，可操作性更强。由于凝集素的本质是蛋白质或糖蛋白，蛋白质含量与凝集活性之间有相关性，因此在凝集素的提取过程中，可以参考蛋白质的提取和检测方法。

参考文献：

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