乳腺癌生物标志物CK19、HER2和血清CEA、CA153联合检测的临床意义

[摘要] 目的 探讨血清和生物肿瘤标志物CEA、CA153、CK19、HER2检测在乳腺癌诊断中的临床价值。 方法 选取不同临床分期乳腺癌患者145例，乳腺疾病60例，正常对照50例。应用蛋白芯片法、流式细胞术和荧光原位杂交技术测定其水平和阳性表达率。结果 CEA、CA153水平在不同临床床分期乳腺癌各组中差异均具有统计学意义（P<0.05），在HER2表达为阳性的不同临床分期各组中差异均具有统计学意义（P<0.01）；CEA、CA153、CK19阳性表达率在不同临床床分期乳腺癌各组中差异均具有统计学意义（P<0.05），而在HER2表达为阳性的平在不同临床床分期乳腺癌各组中，Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌组分别与Ⅲ期、Ⅳ期乳腺癌组相比较，显示出差异具有统计学意义（P<0.01），但Ⅲ期与Ⅳ期之间比较则差异无统计学意义（P>0.05）。结论 CEA、CA153、CK19为乳腺癌重要的肿瘤标志物，测定其水平和阳性表达率可作为临床病情和疗效监测的辅助手段。

[关键词]乳腺癌；肿瘤标志物；CK19；HER2；联合检测

[中图分类号] R725 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）08-37-04

生物肿瘤标志物表皮生长因子受体（HER2）和上皮源性细胞特异性角蛋白19（CK19）表达乳腺癌的鉴别诊断和临床疗效起着较为重要的作用。而血清肿瘤标志物CEA和CA153则更是临床上广泛应用的标志物，且具有取样简便、无创伤、可持续观察等优点。我们通过荧光原位杂交法（FISH）和先进的流式细胞术（FCM）以及多肿瘤标志物蛋白芯片法对145例不同期别的乳腺癌患者及60例乳腺良性肿瘤患者血清中的肿瘤标志物CEA、CA15-3含量和HER2及CK19阳性表达率进行检测，并与50例正常人群进行对照，探讨它们在乳腺癌的诊断、治疗及预后判断中的临床意义，现将实验结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有病历均来源于安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科2008年1月～2009年12月收治的乳腺癌患者，每例均经手术证实，病理资料完整，年龄26～70岁，平均（47.52±17.11）岁。所选病例Ⅰ期患者20例；Ⅱ、Ⅲ期患者各40例；Ⅳ期45例，而Ⅳ期患者中淋巴结转移10例；肝、肺转移各5例；骨转移10例；脑转移5例；多脏器转移10例。而良性乳腺肿瘤患者60例，其中乳腺纤维腺瘤25例；浆细胞性乳腺炎15例；乳腺腺病10例；乳腺潴留囊肿5例；乳腺囊性增生病5例；年龄22～68岁，平均（51.25±16.23）岁。所有受试对象排除妊娠、感染、肝肾功能不全、代谢性疾病和心脑血管疾病等并发症。另外选取本院健康体检中心健康体检者50例，年龄20～70岁，平均（42.17±19.89）岁。

1.2 样本的制备

取受试对象清晨空腹静脉血4.0 mL，分别置EDTA抗凝管2.0 mL、普通管2.0 mL，前者用于CK19检测（应在4 h内完成检测）；后者静置后分离出清亮血清，置洁净试管中，置-70℃低温保存。供CEA、CA153检测。良、恶性肿瘤患者均于手术前取样，而需进行治疗的患者均于治疗前取样。健康对照组于体检时取样，血清待测样品严禁溶血；抗凝血则严禁血凝块。同时收集经外科手术受试对象乳腺癌蜡块作为HER2检测标本。

1.3 检测和判定方法

1.3.1 采用多肿瘤标志物蛋白芯片诊断试剂盒（湖州数康生物科技有限公司提供）测定受试对象血清中的CEA、CA153的含量；以超出正常值上限为阳性（CEA<0.5µg/L、CA153<35 U/mL）

1.3.2 应用流式细胞术方法（美国Beckman Coulte EPICS-XL Ⅱ型流式细胞仪）测定CK19阳性表达率。抗凝外周血100µL，加入10µL CD45 PE-CY5，混均避光，25℃孵育10 min，加入打孔试剂100µL REG A，混均，避光反应10 min，离心弃上清液，沉淀加入100µL REG B避光反应5 min后，加入20µL CK19-FITC/ISO-FITC避光反应15 min，离心，加入1 mL PBS重新悬浮细胞，上机检测。设置CK19本对照和阴性对照，流式细胞术检测每管标本1×106～3×106细胞。激发波长λ=488 nm。阳性判断：CD45perCP标记阴性、CK19阳性者定为阳性（CK19+/CD45ˉ），如图1。

1.3.3 应用荧光原位杂交法（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测HER2基因扩增。HER2（FISH试剂盒选购北京金茗嘉生物技术有限公司，美国VYSIS公司进口分装）检测方法严格按照试剂盒附件说明书，按步骤进行实验。结果分析：计数30个细胞统计Ratio值（Ratio值=30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号部数）。Ratio<1.8为阴性结果，提示：样本无HER2基因扩增；Ratio>2.2为阳性结果，提示：样本中HER2基因发生扩增。当Ratio值在1.8～2.2之间时，可选择增加计数细胞至100个或采取重做FISH实验来判断最终结果，如图2。

采用SPSS15.0统计软件进行统计学分析。CK19和HER2结果选用配对计数资料x2检验（Me Nemar检验）和Kappa检验分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

由表1可见，不同分期的乳腺癌各组CEA、CA153水平及CEA、CA153、CK19阳性表达率极显著高于乳腺疾病组和正常对照组（P<0.01），乳腺疾病组与正常对照组之间差异无显著性（P>0.05）；在不同临床分期乳腺癌之间CEA、CA153水平及CEA、CA153、CK19阳性表达率，Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌组分别与Ⅲ期、Ⅳ期乳腺癌组比较、Ⅲ期乳腺癌组与Ⅳ期乳腺癌组比较均差异具有显著性（P<0.05）；而HER2阳性表达率在不同临床分期乳腺癌各组之间比较差异均无显著性（P>0.05）。

由表2可见，HER2表达均为阳性的不同临床分期的乳腺癌各组之间，CEA、CA153水平差异均具有显著性（P<0.01）；而CEA、CA153、CK19的阳性表达率Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌组与Ⅲ期乳腺癌组、Ⅳ期乳腺癌组比较差异均具有显著性（P<0.01）；但是，Ⅲ期乳腺癌组与Ⅳ期乳腺癌组比较，其CEA、CA153、CK19阳性表达率则差异无显著性（P>0.05）。

实验结果计算得到[1]CEA、CA153、Ck19敏感度分别为30.31%、50.75%、44.62%。而选择3项联合进行检测，按文献[1]判定，对Ⅲ期、Ⅳ期乳腺癌的诊断敏感度可提高到84.60%，而同时也可达到较高的93.43%检测特异度，与文献较一致[2]。

3 讨论

肿瘤标志物是由肿瘤组织或细胞产生的某些生物化学物质并存在于肿瘤组织中。这此生化物质分泌至血液或其他体液中，其含量可代表肿瘤细胞的存在。因此检测肿瘤标志物是早期诊断、治疗肿瘤的重要手段之一[3]。

CA153被认为是一种较好的乳腺癌血清标志物[4]，并在乳腺癌中过度表达，与临床分期、肿瘤负荷大小、腋窝淋巴结状况及雌性受体相关[5]，而广泛应用于临床的诊断和治疗活动中。但对早期的乳腺癌阳性表达率较低[6]。我们的实验结果也显示在Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌受试者中，其阳性表达率也只有18.33%，与文献[6]相一致。因此CA153单独应用具有一定的局限性。尤其是因为对早期乳腺癌诊断敏感度较低而不能满足临床诊疗要求[7]。

CEA是胚胎性抗原，胎儿和成人消化道均产生。正常细胞分泌CEA进入胃肠道，而失去极性的癌细胞分泌的CEA则进入血液和淋巴，导致肿瘤患者血清中CEA异常性增高有文献研究表明，乳腺癌患者中CEA水平与肿瘤的分和进展呈正相关关系[8]。我们的实验结果也得到相同的结论。

CK19在乳腺癌发生早期即有阳性表达。尤其在乳腺癌中高表达，同时其阳性表达率与肿瘤的负荷、转移和临床疗效密切相关[9]。因此它是乳腺癌微转移中研究、应用最多的生物标志物之一[10]。CK19检测多采用PT-PCR方法，但该方法假阳性率高、易污染、特异度较低且费时费力成本高等缺点，而该法阳性检出率也只有36%左右[11]，在临床应用上受限。我们采用先进的流式细胞术（FCM）检测外周血CK19阳性表达率，不仅显示出其客观准确性，同时还可进行细胞计数并对细胞进行诊断。其敏感度达1～5×10-5。另外标本为单细胞悬液，取样简便，极大地适用于临床[12-13]。

HER2基因过表达不仅与肿瘤的发生、发展有关，而且是评估临床预后的重要指标[14]。我们实验显示其总的阳性表达率为33.10（48/145），在不同临床分期限各组乳腺癌患者比较差异均无显著性（P>0.05）。但检测HER2基因有无扩增对乳腺癌患者后期治疗、指导临床在化疗药物选择及判断疗效十分重要[14]。本实验结果提示：CEA、CA153、CK19对观察乳腺癌患者病情进展、判断疗效可能具有一定的临床意义。另外也提示在临床工作中应联合应用多指标检测，可以弥补单指标的缺陷和不足，提高诊断正确率，避免漏诊、误诊的发生。如本实验单指标的敏感度为30.31%～50.75%，而三项指标联合检测敏感度可提高到84.60%。

[参考文献]

[1] 符本琪，刘献华，佘炜，等.多肿瘤蛋白芯片检测系统临床应用评价[J].实用医院临床杂志，2006，3（2）：34-35.

[2] Pavicevic R，Bubanovic G，Franjevic A，et al.CYFRA 21-1 in non-small cell lung cancer-standardisation and application during diagnosis[J].Coll Antropol，2008，32（2）：485-498.

[3] 李健，刘雄英，陈瑞娥.联合检测血清CA153、CA125、CA19-9在乳腺癌早期诊断中的价值[J].实用医技杂志，2008，15（13）：1696-1698.

[4] Massidda B，Ionta MT，Foddi MR.Usefulness of pyridinium crosslinks and CA153 as markers in metastatic bone brest carcionoma[J].Anticancer Res，1996，16（4）：2221-2223.

[5] 雷钧，邵江华.Cyclin D与恶性肿瘤关系的研究进展[J].实用临床医学，2007，8（11）：127-129.

[6] 承晓定，施海文.血清CA153、CEA联检对乳腺癌的诊断价值[J].交通医学，2008，22（6）：631-633.

[7] 张武，高琦，张玲，等.多项肿瘤标志物对肿瘤敏感性实测统计[J].放射免疫学杂志，2001，14（6）：355-356.

[8] 罗光辉，曲士杰，方机.联合检测血清肿瘤四项对恶性肿瘤早期诊断及动态检测的意义[J].广东医学，2004，25（6）：703-704.

[9] 邓君，杨洋.细胞角蛋白19基因表达及其肿瘤标志物在乳腺癌诊断中的应用[J].国外医学（临床生物化学与检验学分册），26（7）：390-392.

[10] Pimpec-Barthes FL，Danel C，Lacave R，et al. Association of CK19 mRNA detection of occult cancer cell in mediastinal lymph nodes in no-small cell lung carcinoma and high risk of early recurrence[J].Eur J Cancer，2005，41（2）：306-311.

（下转第页）

（上接第页）

[11] Stathopulou A，Vlachonikolis I，Mavroudis D，et al.Molecular detection of eytokeratin-19-positive cells in the peripheral blood of patients with operable breast cancer： evaluation of their prognostic significance[J].J Clin Onco，2002，20：3404-3412.

[12] Lin JC，Chen KY，Wang WY，et al. Evaluation of cytokeration mRNA as a tumor marker in the peripheral blood of nasopharynged carcinoma patients receiving concurrent chemoradiotherapy[J].Int J Cancer，2002，97：548-553.

[13] Maguire D，O’Sullivan GC，MCNamara B，et al.Bone marrow micromet-astases in patients with brian metastases epithelid cell tumors[J].QJM，2000，93（9）：611-615.

[14] 王晓兰，姚凡，刘楠，等.FISHd乳腺癌组织HER2/neu原癌基因检测上的应用及其临床意义的研究[J].中国医科大学学报，2008，37（5）：664-666.

（收稿日期：2013-03-18）