叶酸脂质体包裹的MYCN,siRNA在裸鼠体内靶向治疗作用的初步研究

[摘要] 目的 研究叶酸受体为靶向的脂质体包裹MYCN基因小干扰性RNA在神经母细胞瘤裸鼠骨髓、骨转移模型中的靶向性及治疗作用。 方法 16只成功建立神经母细胞瘤骨髓、骨转移模型的裸鼠，将其随机分为靶向性研究组（4只）和疗效性研究组（12只）。靶向性研究组裸鼠静脉给予CY3荧光标记叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA，荧光显微镜检测CY3在体内瘤组织及重要器官的荧光强度。疗效性研究组12只裸鼠随机分MYCN siRNA组和无关siRNA组，静脉分别给予叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA与叶酸脂质体包裹的无关siRNA，采用荧光定量PCR检测肿瘤组织MYCN mRNA表达，原位细胞凋亡检测法（TUNEL）观察肿瘤细胞凋亡数。 结果 CY3荧光标记的叶酸脂质体MYCN siRNA给药8 h后，荧光主要分布在肿瘤组织内，MYCN siRNA组瘤组织中MYCN mRNA的表达量明显较无关siRNA组降低（P ＜ 0.05），MYCN siRNA组凋亡细胞数量高于无关siRNA组（P ＜ 0.05）。 结论 ①叶酸脂质体MYCN siRNA经静脉给药后主要靶向瘤组织，叶酸脂质体是肿瘤基因治疗的有效载体；②叶酸脂质体MYCN siRNA在体内显著下调肿瘤MYCN mRNA的表达，促进肿瘤细胞凋亡，有望成为神经母细胞瘤治疗的新药物。

[关键词] 神经母细胞瘤；MYCN；叶酸受体；脂质体；动物模型

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）06（a）-0022-03

神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤，占儿童肿瘤的7%～10%。多数患儿就诊时肿瘤已转移，转移部位以淋巴结、骨髓及骨多见，在强烈化疗、自体造血干细胞移植及诱导治疗后，其预后仍然很差。目前广泛应用的化疗由于其缺乏特异性，对正常组织细胞毒副作用大，需要探索新的靶向治疗方法。20%～25%神经母细胞瘤患儿有MYCN原癌基因扩增，大量研究显示，MYCN扩增提示疾病预后不良。因此，MYCN是治疗神经母细胞瘤的特异性分子靶点之一。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是近年发展起来的研究基因功能的实验技术，RNAi或基因沉默由小分子干扰核糖核酸（small interfering RNAs，siRNAs）介导，降解与其同源的mRNA。给予针对肿瘤细胞内的癌基因或促癌基因的siRNA药物以介导肿瘤细胞基因沉默，已成为肿瘤分子靶向治疗的热点。部分siRNA药物已进入Ⅰ期临床试验，但仅限于肿瘤局部给药，如肿瘤内注射、眼内给药等。因siRNA全身给药有血流稳定性差和体内分布差的缺点，静脉应用仍停留在动物实验研究阶段。

为了把siRNA定向地输送到肿瘤细胞，笔者选择脂质体作为载体，用纳米脂质体包裹siRNA，提高药物在体内的稳定性及靶向性，同时在其表面耦联叶酸分子，通过叶酸分子与肿瘤细胞表面叶酸受体特异性结合，实现主动靶向治疗。在体外实验中，笔者体外化学合成并筛选出针对MYCN基因的siRNA，应用叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA作用于神经母细胞瘤LA-N-5细胞，MYCN基因mRNA表达水平显著下降[1]。本实验仍以MYCN基因为靶点，研究叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA在裸鼠体内的靶向治疗作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

LA-N-5细胞用含15%胎牛血清的RPMI 1640培养，置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。造模当天用0.1％胰蛋白酶和0.1％EDTA的混合溶液进行消化，无血清培养液调节细胞浓度至1×107/mL。

1.2 叶酸脂质体siRNA制备

叶酸脂质体MYCN siRNA及CY3标记的叶酸脂质体MYCN siRNA均由美国俄亥俄州大学药学院Robert J Lee教授合成惠赠。MYCN siRNA序列为：正义链：5’-CGG AGA UGC UGC UUG AGA Adtdt-3’；反义链：5’-UUC UCA AGC AGC AUC UCC Gdtdt-3’。

1.3 实验动物分组及骨髓、骨转移模型的建立

BALB/C裸鼠16只，雌性，4周龄，重15 g左右，由解放军总医院动物实验中心提供，均在无特定病原体状态（SPF）条件下饲养于层流架内，饲料、饮水及垫料均经高压灭菌处理，清洁水和饲料供小鼠自由摄入。裸鼠匀用10 g/L戊巴比妥钠（75 mg/kg）麻醉，右股骨及膝盖皮肤用碘伏消毒。从股骨末远端皮肤做一小侧切口（8～10 mm），沿筋膜钝性分离股骨侧面肌肉，用镊子固定暴露的股骨下段。用26 G的无菌针从髌骨上、两股骨髁间钻过骨质进入骨髓腔。然后取出无菌注射针，换Humilton注射器的穿刺针，插入骨髓腔直到进入股骨近端干骺端。缓慢注射入人神经母细胞瘤LA-N-5细胞悬液5 μL，约1×105个肿瘤细胞，然后缓慢拔出针头，后用骨蜡封闭针孔缝合皮肤伤口。待裸鼠苏醒后回笼。5周末肿瘤直径径达5 mm，骨髓、骨转移模型建立成功，随机取4只用于靶向性研究实验，12只用于疗效性研究实验。

1.4 MYCN siRNA靶向性研究实验步骤

4只成瘤祼鼠，经鼠尾静脉给予CY3标记的叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA，给药剂量为3 mg/kg，8 h后处死小鼠，取出小鼠股骨瘤体、心、肺、肝、肾，冰生理盐水迅速清洗残留血液，OCT包裹，冰冻切片机切片，制成4 μm切片。荧光显微镜200倍视野下观察，每只小鼠的每个器官随机选取3个视野采集图像，并用计算平均累积光密度值（IOD）进行各器官荧光强度比较。

1.5 MYCN siRNA体内效应实验步骤

12只裸鼠随机分为两组，每组6只，分别经鼠尾静脉注射叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA、叶酸脂质体包裹的无关siRNA，连续5 d，给药剂量为3 mg/（kg·d）。于第6天断颈法处死，取下裸鼠股骨肿瘤，-80℃保存。

1.6 MYCN基因实时定量PCR检测

用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA，经电泳显示28S、18S清晰两条带，用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录，应用实时荧光定量RT-PCR法（Roche 480Ⅱ型荧光定量PCR仪）检测瘤组织中MYCN基因mRNA表达水平，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。MYCN基因上游引物序列：5’-CTCAGTACCTCCGGAGAG-3’，下游引物序列：5’-GGCATCGTIGAGGATC-3’，内参照GAPDH基因上游引物序列：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’；下游引物序列：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。实时荧光定量RT-PCR反应体系20 μL，扩增程序为：95℃ 10 min，以95℃ 15 s，60℃ 60 s循环40次。

1.7 TUNEL法检测裸鼠肿瘤细胞凋亡

脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）介导的d-UTP缺口末端标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediate d-UTP nick end labeling，TUNEL）检测RB细胞凋亡：行4 μm冰冻切片，丙酮固定，3％过氧化氢-甲醇溶液处理切片20 min，PBS洗涤3 min×3次。蛋白激酶K 37℃消化20 min，TBS液洗涤3 min×3次。每一标本加含TdT和地高辛标记的脱氧尿苷酸（digoxigenin labelled desoxyuridinetriphosphate，DIG-UTP）各11及18的标记缓冲液共20 μL，37℃湿盒中标记2 h，TBS洗涤3 min×3次。加封闭液50 μL，室温孵育30 min，甩掉封闭液后加生物素化的抗地高辛抗体50 μL，37℃湿盒中孵育30 min，TBS洗涤3 min×3次。加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物溶液（strept avidin-biotin-peroxidase complex，SABC）50 μL，37℃下反应60 min，TBS洗涤3 min×3次。DAB显色20 min，苏木素轻度复染。脱水，透明，封片，于显微镜下观察，每张切片随机选取5个400倍视野照相，计算每1 000个细胞中TUNEL染色阳性细胞数百分比，作为凋亡指数（AI）。

1.8 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件处理数据，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CY3标记纳米脂质体MYCN siRNA体内分布

荧光显微镜200倍视野下观察，曝光时间为1 s，股骨瘤体、心、肺、肝、肾的累积光密度（IOD）比较见图1。CY3荧光主要集中在肿瘤组织内，肝脏、肾次之，心和肺内几乎没有可见荧光，见图2。

2.2 两组肿瘤组织中MYCN mRNA检测结果比较

由计算机自动分析荧光信号，按照2-△△CT相对定量计算出各样品的MYCN基因相对定量结果。MYCN siRNA组瘤组织中MYCN mRNA的表达量[（1.457±0.704）%]明显低于无关siRNA组[（3.093±0.911）%]，差异有高度统计学意义（P ＜ 0.01）。

2.3 两组肿瘤组织中细胞凋亡结果比较

TUNEL染色阳性物质呈棕黄色，位于细胞核内，紧贴核膜。与同部位连续切片HE染色标本对比，可见大片状或簇状阳性着色位于肿瘤细胞退化和坏死区，而增生活跃区则呈点状着色或不着色。计数阳性细胞时应排除坏死区，避免假阳性。TUNEL染色应能鉴别凋亡细胞与坏死细胞。MYCN siRNA组AI值[（2.97±0.44）%]高于无关siRNA组[（0.65±0.27）%]，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。

3 讨论

MYCN基因是编码转录因子的MYC癌基因家族成员之一，只在胚胎发育过程中表达[2]。由于MYCN基因扩增在神经母细胞瘤肿瘤形成中的重要作用，因此抑制MYCN基因表达成为高危神经母细胞瘤的基因治疗策略。细胞学实验显示，通过对MYCN基因序列合理设计siRNA，降低MYCN基因表达，可以抑制肿瘤细胞生长，激活细胞凋亡及向神经细胞分化[1-3]。

静脉给予无载体siRNA后，主要分布在肝脏，并通过胆囊和空肠代谢[4]，且siRNA跟其他核酸类药物一样，有药代动力学差的缺点[5]。因此，siRNA体内给予需要靶向、高效、安全的载体系统。纳米脂质体平均直径约130 nm，血循环时间长，由于其在肿瘤中渗透率高，且因“EPR效应”被动地在肿瘤部位蓄积[6]。将siRNA包埋在脂质体可以延长siRNA在肿瘤内的作用时间。因此，纳米脂质体是抗癌药物理想载体。叶酸是无毒的小分子化合物，且与叶酸受体有高度亲和性，并在叶酸受体的许多恶性肿瘤中过度表达，尤其在儿童肿瘤中，叶酸代谢对肿瘤生长、增殖起着至关重要的作用[7]。更重要的是，正常造血细胞表达的叶酸受体β无功能，不会吞噬叶酸受体为靶向的脂质体介导的药物成分，因此叶酸受体是肿瘤靶向递药的特异靶点。既往研究显示，以叶酸脂质体作为递药载体可以增强多柔比星的抗瘤效果并克服P糖蛋白介导的多重耐药，其机制可能与叶酸受体依赖性细胞毒性及抗血管生成活性有关[8]。本研究评价了CY3荧光标记的叶酸脂质体siRNA在荷瘤小鼠体内的分布及对肿瘤组织的选择性。给药8 h后荧光主要分布在肿瘤，少量在肝脏、肾脏，而肺及心肌内几乎没有，说明叶酸脂质体作为递药载体，在神经母细胞瘤动物模型中靶向性较强，是siRNA药物的有效载体。静脉给药5 d后，裸鼠体内MYCN mRNA显著下调，肿瘤细胞凋亡数目增加。MYCN通过调节靶基因的表达，促进细胞增生，促使细胞从G0期进入G1期，而给予MYCN siRNA沉默MYCN表达，有促进肿瘤细胞凋亡的作用，与体外实验结果[1-3]相符。

综上所述，叶酸脂质体MYCN siRNA在裸鼠体内靶向肿瘤组织，叶酸脂质体是肿瘤基因治疗的有效载体。叶酸脂质体MYCN siRNA在体内显著下调肿瘤MYCN mRNA的表达，促进肿瘤细胞凋亡，有望成为神经母细胞瘤治疗的新药物。

[参考文献]

[1] 冯晨，唐锁勤，王建文，等.以叶酸受体为靶向的脂质体介导MYCN基因小干扰RNA体外抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞的增值[J].军医进修学院学报，2010，31（2）：161-163.

[2] Pearson A，Lunec J. The MYCN oncoprotein as a drug development target [J]. Cancer Lett，1997，（3）：125-130.

[3] Nara K，Kusafuka T，Yoneda A，et al. Silencing of MYCN by RNA interference induces growth inhibition，apoptotic activity and cell differentiation in a neuroblastoma cell line with MYCN amplification [J]. Int J Oncol，2007，30（5）：1189-1196.

[4] Huang Y，Hong J，Zheng S，et al. Elimination pathways of systemically delivered siRNA [J]. Mol Ther，2011，19（2）：381-385.

[5] Birmingham A，Anderson EM，Reynolds A，et al. 3"" UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets [J]. Nat Methods，2006，3：199-204.

[6] Stevens PJ，Sekido M，Lee RJ. A folate receptor-targeted lipid nanoparticle formulation for a lipophilic paclitaxel prodrug [J]. Pharm Res，2004，21（12）：2153-2157.

[7] Daldrup HE，Hawkins RA，Meier R，et al. Receptor imaging of pediatric tumors： clinical practice and new developments [J]. Pediatr Radiol，2008，38（11）：1154-1161.

[8] Pan X，Lee RJ. Tumour-selective drug delivery via folate receptor-targeted liposomes [J]. Expert Opin Drug Deliv，2004，1（1）：7-17.

（收稿日期：2012-04-20 本文编辑：卫轲）