6MV—X线对人食管癌细胞系EC—9706Bcl—2基因表达的影响

【摘要】 目的 研究X线对人食管癌细胞系EC-9706 B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）基因表达的影响。方法 采用RT-PCR法测人食管癌细胞系EC-9706经0、4、6 Gy的X线照射后1、6、24 h Bcl-2基因表达的变化。结果 X线照射可以显著降低人食管癌细胞株EC-9706Bcl-2基因的表达。结论 X线照射人食管癌细胞系EC-9706细胞后Bcl-2基因的表达在0～6 Gy无剂量依赖性， 在不同的时间点上Bcl-2的表达稳定。

【关键词】 人食管癌细胞系；Bcl-2；RT-PCR

食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤， 放疗是主要的治疗方法之一。放疗的主要机制是诱导细胞凋亡。Bcl-2是目前发现的抗凋亡作用最强的基因之一， Bcl-2的高表达可以抑制正常细胞或肿瘤细胞的凋亡。本文采用RT-PCR法检测X线作用后Bcl-2基因表达的变化， 进而探讨该基因与食管癌放疗敏感性之间的关系。

1 材料与方法

1. 1 材料 RPMI-1640培养液， 标准胎牛血清、胰蛋白酶、TRIzolR Reagent、PCR反应试剂盒、PCR引物、反转录试剂盒、GAPDH基因、Bcl-2基因、培养皿35 mm×10 mm。仪器设备：水套式CO2培养箱、置显微镜、紫外分光光度计、实时定量PCR仪、台式高速离心机、低温离心机、PE管、PCR反应管。人食管癌细胞系EC-9706购自中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室。

1. 2 方法

1. 2. 1 将细胞培养至对数期， 制备单细胞悬液， 以2×106个细胞分别接27个培养皿中， 注意尽量使细胞分散均匀， 将27个培养皿置入培养箱内培养24 h后分成三组。以酒精消毒医用直线加速器治疗床， 铺双层湿毛巾补偿厚度使总厚度达到1.5 cm， 培养皿置于其上， 以0、4、6 Gy的6MV-X线分别照射， 照射时培养皿置于照射野边缘2 cm以内， 机头旋转180°，射线从下方入射， 剂量率2 Gy/min。SSD（源皮距）为100 cm， 射野大小为22 cm×15 cm。照射后立即送回实验室， 更换培养液， 在培养箱内继续培养。在照射后1 h时， 每剂量组各取3皿， 制备成单细胞悬液， 用吸管移至无菌离心管， 以1000 rpm转速离心5 min， 悬浮细胞沉淀后弃去上清， 再用PBS清洗1次， 再次离心并弃去上清， 放入-80℃冰箱保存。至6、24 h时重复上述操作。

1. 2. 2 用TRIZOL试剂提取所收集细胞的总RNA（按操作说明进行），紫外分光光度计测定所提取样本在波长260 nm和在波长280 nm处的吸光度（OD260和OD280），计算RNA的纯度和浓度，确保RNA的纯度在1.9～2.0。以琼脂糖电泳检测RNA的完整性， 各样本均出现三条清晰条带且无弥散， 从上至下分别是5、18和28srRNA， 且经分析28srRNA的亮度约是18srRNA的1.5～2.0倍， 说明所提取的总RNA完整性好， 无RNA酶的降解。将所提取的样本总RNA置于-80℃保存备用。

1. 2. 3 引物的设计与合成 Bcl-2和GAPDH上下游引物参照文献， Bcl-2[1] 上游：CTGGTGGGAGCTTGCATCAC下游：ACAG CCTGCAGCTTTGTTTC GAPDH[2]；上游：TGGGCTACACTGAGCA CCAG， 下游：CAGCGTCAAAGGTGG AGGAG。

1. 2. 4 cDNA的合成 利用TaKaRa反转录试剂盒（ExScriptTM RT-reagent Kit）将提取的RNA进行反转录， 在反应体系为10 µl的逆转录反应管中加入组分， 见表1。

3 讨论

Bcl-2是迄今研究最深入、最广泛的凋亡调控基因之一。细胞凋亡受凋亡相关基因调控， 在肺癌、前列腺癌、乳腺癌以及结肠癌等实体瘤的细胞中发现Bcl-2的异常表达使肿瘤细胞存活时间延长， 同时还抑制化疗药物、放射线、癌基因等多种因素介导的细胞凋亡， 使治疗变得困难。通过上述实验提示食管癌也高表达Bcl-2蛋白， 因此研究Bcl-2基因对于食管癌的放化疗及综合治疗具有一定的临床意义。

张维珍等[3]的研究结果显示Bcl-2的表达与放疗疗效呈负相关， 提示Bcl-2阳性表达尤其是高表达时应考虑调整放疗方法和剂量。为了探讨6MV-X线对食管癌细胞系EC-9706的杀伤机制， 作者对各分组EC-9706细胞内Bcl-2的mRNA采用荧光定量RT-PCR技术进行了检测。结果显示， 4 Gy X线照射后1 h， Bcl-2基因的表达急剧下降， 与其他研究的结论相符， X射线可降低Bcl-2的表达。以>4 Gy剂量照射后， Bcl-2的表达却与4 Gy组基本相同， 而以<4 Gy的剂量照射其表达的变化情况有待进一步研究。因为Bcl-2是凋亡抑制基因， 故而又被称为细胞的“生死开关”， 作者认为放射线对食管癌细胞的杀灭， 与射线降低Bcl-2表达启动了细胞凋亡程序有关。

参考文献

[1]Tsujimoto Y， Croce CM. Analysis of the structure，transcripts，and protein products of bcl-2， the gene involved in human follicular lymphoma. Proc Natl Acad Sci USA， 1986（83）：5214-5218.

[2]Hidetoshi T， Akira M， Akemi I， et al. Aberrant expression of apoptosis-related molecules in psoriatic epidermis. Journal of Dermatological Science， 2002（28）：187-197.

[3]张维珍，张阳，孔天东，等.食管癌中C-erbB-2， bcl-2， mdr-1的表达与同步放化疗疗效及预后关系的研究.实用诊断与治疗杂志， 2007， 21（12）：921-923.

[收稿日期：2014-08-11]