POLD3在肝细胞癌中的表达及临床病理意义分析

【摘要】目的探讨DNA聚合酶δ3（POLD3）在肝细胞癌（HCC）中的表达及临床意义。方法通过免疫组织化学和实时定量多聚酶链反应检测POLD3在134对HCC肿瘤组织与肿瘤旁组织样本中的表达，通过实时定量多聚酶链反应和蛋白印迹法检测SMCC-7721及QSG-7701中POLD3的表达情况。结果（1）与肿瘤旁组织相比较，POLD3 mRNA及蛋白在HCC肿瘤组织中的表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）；体外细胞学结果与之相一致。（2）POLD3表达与HCC肿瘤大小相关，POLD3表达水平越低者，具有更大的肿瘤直径（P=0.017）。（3）POLD3表达与HCC肿瘤组织学分化程度相关，POLD3表达水平越高者，其肿瘤分化程度越高（P=0.001）。结论POLD3在HCC肿瘤组织中表达下调，并与肿瘤组织学分化程度及大小相关，这些结果提示POLD3表达可能促进HCC的发生与演进。

【关键词】POLD3；肝细胞癌；表达；临床病理意义

中图分类号：R735.7文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.05.001

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinicopathological significance of DNA polymerase delta （POLD3） in hepatocellular carcinoma （HCC）.MethodsThe expression of POLD3 in 134 pairs of HCC tumor tissues and adjacent tissues were detected by immunohistochemistry and real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）.And the expression of POLD3 in SMCC-7721 and QSG-7701 cells was analyzed by RT-qPCR and western-blotting assay.ResultsThe expression of POLD3 mRNA and protein in tumor tissues with HCC decreased while comparing with that in the peri-tumor tissue，and difference was statistically significant（P<0.05）.This decreasing POLD3 expression in tumor tissues was consistent with the results from in vitro analyses.（2） The expression of POLD3 was associated with tumor size，and the lower the level of POLD3 expression，the larger the tumor diameter（P=0.017）.（3）The expression of POLD3 was related to histological differentiation of tumor，and individuals with increasing expression level of POLD3，would have higher degree of tumor differentiation （P=0.001）.ConclusionThe expression of POLD3 is down-regulated in the tumor tissues of HCC and is related to the degree and size of histological differentiation，which suggests that the expression of POLD3 may promote the development and progression of HCC.

【Key words】POLD3；HCC；expression；clinicopathological significance

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，该肿瘤的具体发病机制仍为当前生命科学研究的热点问题[1～2]。近年来，研究发现DNA聚合酶δ3（DNA polymerase delta，POLD3）是一种重要的DNA修复基因，对维持基因组结构的稳定性是至关重要的，它的突变体和表达失调影响细胞分化、增殖、凋亡等生物学行为，涉及胃腺癌、结直肠癌、卵巢癌等多种肿瘤发生发展的过程[3～11]。然而，有关POLD3在肝癌中的表达及其临床意义如何，至今为止国内外文献报道甚少。

1材料与方法

1.1研究对象HCC研究对象入选标准如下：经病理诊断确诊为HCC的患者、术前无放疗与化疗、具有完整的临床病理资料、具有可供研究的合适组织样本、患者本人同意参与本次研究。排除标准为：未经病理组织诊断确认者、术前具有放化疗史者、资料不完整者、无可用于研究分析的合适样本者、不同意参与者。根据以上标准，在2012年1月至2017年10月间共收集到134例符合要求的HCC研究对象，收集所有研究对象的石蜡组织标本用于POLD3蛋白表达分析；此外，我们也收集到12例新鲜组织样本用于POLD3 mRNA表达分析。在本研究中，我们定义肿瘤组织为HCC癌组织，肿瘤旁组织为距离肿瘤边缘5 cm处的肝组织。

1.2细胞系及细胞培养HCC细胞SMCC-7721和非HCC肝细胞QSG-7701均购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，所有细胞均在含有5%胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养环境为5% CO2气体和37 ℃的恒温环境。

1.3临床标本收集根据前述研究对象的入选与排除标准，收集在右江民族医学院附属医院住院符合要求的134例肝癌患者，按Edmondson-Steiner分级法（原发性肝癌诊疗规范，2017年版）进行分级：Ⅰ～Ⅱ级为高分化肝细胞性肝癌，98例；Ⅲ～Ⅳ级为中低分化肝细胞性肝癌，36例。

1.4POLD3蛋白表达水平的检测分别使用免疫组织化学法及蛋白印迹法检测组织样本与细胞样本中的POLD3蛋白表达水平，POLD3抗体购自Santa Cruz生物科技公司，所有实验均设立阳性与阴性对照，按照标准操作流程完成，结果经高年资病理医师确认。POLD3蛋白的阳性定位于细胞核或细胞浆，以有明显的棕色颗粒作为阳性的判定标准，具体的判定方法见参考文献[12]。

1.5POLD3 mRNA表达水平的检测按照已报道的实时荧光定量PCR技术检测新鲜组织样本和体外培养的细胞样本中的POLD3 mRNA表达水平[3]，在本研究，我们以ACT作为内参，采用2-△△定量法线性化分析POLD3 mRNA的相对表达水平。

1.6统计学方法所有数据均采用SPSS 23.0软件进行处理，采用t检验或χ2检验比较组间差异，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2结果

2.1POLD3蛋白在HCC的表达情况免疫组织化学检测结果显示：与肿瘤组织相比，POLD3蛋白在HCC肿瘤旁组织中具有更高的表达，差异有统计学意义。见图1A和1B，表1。体外细胞学实验结果也显示癌细胞中的POLD3蛋白水平下调，差异有统计学意义。见图1C。

2.2POLD3 mRNA在HCC组织中的表达我们通过RT-qPCR技术检测了12例新鲜HCC组织中POLD3 mRNA的表达情况，发现与肿瘤旁组织相比，肿瘤组织中的POLD3 mRNA表达水平下降，二者差异有统计学意义（P<0.001）。见表2。体外细胞学分析有类似发现。见表3。

2.3POLD3表达与HCC临床病理特征的关系POLD3与HCC组织学分化程度、肿瘤直径大小之间的差异均有统计学意义（P<0.05），与其他病理特征的差异均无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3讨论

POLD3作为POLD的第三个亚基，在各项生命活动中起到DNA修复的作用，在染色体复制过程中同样起到重要的作用，其功能一直被研究者关注着。POLD3能稳定POLD1-POLD2的相互调节作用，并且通过C-终端PIP盒便于POLD复合体与PCNA的相互调节作用、参与跨损伤合成及DNA甲基化的进程[13～20]。Hirota K等[21]研究表明，POLD3有助于跨損伤合成在复制叉上操作或关闭复制叉的作用，但在后复制间隙填充的作用不明显。Murga M等[22]发现POLD3在RS诱导DNA修复过程中的DNA合成具有独特的作用，且通过细胞学实验得到POLD3缺陷导致复制应激和细胞死亡。Zhou Z等[23]发现POLD3在小鼠胚胎干细胞和精母细胞的DNA双链断裂（DNA double strand breaks，DSB）修复、端粒维持和基因组稳定性中都起着重要作用。西班牙国家癌症研究中心的研究人员发现了POLD3在DNA复制过程中的关键作用，没有POLD3的细胞不分裂，细胞就会死亡，甚至是胚胎发育的过程和新生物体的诞生都可能被削减；没有POLD3的细胞就会丧失复制基因组的能力而发生死亡。对于这种现象不仅存在于肿瘤细胞，正常的细胞也是如此，但是POLD3在正常细胞有多大程度的作用是至关重要的，目前对于POLD3在正常细胞的这种功能尚不是很清楚。

近几年，学者发现POLD3与肿瘤的形成有着密切联系，其调控异常可能导致癌细胞恶性分化、增殖。陆茵茵等[3]发现POLD3在胃腺癌中表达下调，且这种表达下调与肿瘤分化、增殖及预后不良相关。Dunlop等[4]通过大样本病例对照实验发现POLD3的基因其中一个位点的突变体与大肠癌的发生相关，且POLD3在该位点突变后形成的突变体能够增加结直肠癌的发病风险，然而他们并没有探讨POLD3在结直肠癌中的表达情况及分析其与临床病理参数是否存在一定的关系。Willis等[5]采用meta分析众多卵巢癌中POLD3的表达情况，结果发现在预后不良的卵巢癌患者中POLD3表达减少。

为了探讨POLD3与肝癌临床病理特征之间是否存在一定的关系，我们从肝癌组织和肝癌细胞株两个方面进行了研究；在临床上我们通过一系列的筛选标准最后收集134对符合要求的标本。本课题一方面通过IHC、WB技术检测肝癌肿瘤组织、癌旁组织、肝癌细胞株及肝细胞株中POLD3蛋白的表达情况，另一方面通过RT-qPCR技术检测12例新鲜肝组织、人肝癌细胞株SMCC-7721及人肝细胞株QSG-7701中POLD3mRNA的表达情况。通过研究我们发现POLD3在肝癌组织和肝癌细胞中表达下调，这种异常表达既出现在蛋白水平，也出现在mRNA水平上。我们得到的实验结果：肝癌组织学分化程度越高，POLD3的表达越高；肝癌直径越大，POLD3的表达越低，暗示着POLD3与肝癌的分化、增殖相关。这一点与以上学者所得到的研究结果相一致，我们猜测干扰POLD3基因的突变可以抑制肝癌的恶性分化、增殖，这也许对于肝癌及其相关肿瘤是一种有重要价值的研究结果。

因此，不管是从正常的生命活动还是从肿瘤形成的过程，进一步探讨POLD3基因的调控机制与肿瘤之间的关系，这将为肿瘤治疗提供新的选择，为未来靶点治疗提供新的思路。

参考文献

[1]Yu SJ.A concise review of updated guidelines regarding the management of hepatocellular carcinoma around the world：2010-2016[J].Clin Mol Hepatol，2016，22（1）：7-17.

[2]Cao MQ，You AB，Zhu XD，et al.MiR-182-5p promotes hepatocellular carcinoma progression by repressing FOXO3a[J].Journal of hematology & oncology，2018，11（1）：12.

[3]陸茵茵，王超，吴雪铭，等.POLD3在胃腺癌中的表达及临床意义分析[J].右江医学， 2016，44（1）：1-5.

[4]Dunlop MG，Dobbins SE，Farrington SM，et al.Common variation near CDKN1A，POLD3 and SHROOM2 influences colorectal cancer risk[J].Nature genetics，2012，44（7）：770-776.

[5]Willis S，Villalobos VM，Gevaert O，et al.Single Gene Prognostic Biomarkers in Ovarian Cancer：A Meta-Analysis[J].PLoS One，2016，11（2）：e0149183.

[6]Rayner E，van Gool IC，Palles C，et al.A panoply of errors：polymerase proofreading domain mutations in cancer[J].Nat Rev Cancer，2016，16（2）：71-81.

[7]Spier I，Holzapfel S，Altmüller J，et al.Frequency and phenotypic spectrum of germline mutations in POLE and seven other polymerase genes in 266 patients with colorectal adenomas and carcinomas[J].Int J Cancer，2015，137（2）：320-331.

[8]Valle L，Hernández-Illán E，Bellido F.New insights into POLE and POLD1 germline mutations in familial colorectal cancer and polyposis[J].Hum Mol Genet，2014，23（13）：3506-3512.

[9]Bellido F，Pineda M，Aiza G，et al.POLE and POLD1 mutations in 529 kindred with familial colorectal cancer and/or polyposis：review of reported cases and recommendations for genetic testing and surveillance[J].Genetics in medicine：official journal of the American College of Medical Genetics，2016，18（4）：325-332.

[10]Tumini E，Barroso S，Calero CP.Roles of human POLD1 and POLD3 in genome stability[J].Sci Rep，2016，6：38873.

[11]Nicolas E，Golemis EA.POLD1：Central mediator of DNA replication and repair，and implication in cancer and other pathologies[J].Gene，2016，590（1）：128-141.

[12]Long XD，Ma Y，Zhou YF，et al.Polymorphism in xeroderma pigmentosum complementation group C codon 939 and aflatoxin B1-related hepatocellular carcinoma in the Guangxi population[J].Hepatology，2010，52（4）：1301-1309.

[13]Hirota K，Tsuda M，Mohiuddin null，et al.In vivo evidence for translesion synthesis by the replicative DNA polymerase δ[J].Nucleic Acids Res，2016，44（15）：7242-7250.

[14]Johnson RE，Klassen R，Prakash L.A Major Role of DNA Polymerase δ in Replication of Both the Leading and Lagging DNA Strands[J].Molecular cell，2015，59（2）：163-175.

[15]Makarova AV，Stodola JL.A four-subunit DNA polymerase δ complex containing Pol δ accessory subunits is essential for PCNA-mediated mutagenesis[J].Nucleic acids research，2012，40（22）：11618-11626.

[16]Rahmeh AA，Zhou Y，Xie B，et al.Phosphorylation of the p68 subunit of Pol δ acts as a molecular switch to regulate its interaction with PCNA[J].Biochemistry，2012，51（1）：416-424.

[17]Kim MS，Machida Y，Vashisht AA，et al.Regulation of error-prone translesion synthesis by Spartan/Clorf124[J].Nucleic Acids Rearch，2013，41（3）：1661-1668.

[18]Liu G，Warbrick E.The p66 and p12 subunits of DNA polymerase delta are modified by ubiquitin and ubiquitin-like proteins[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，349（1）：360-366.

[19]Ghosal G，Leung JW，Nair BC，et al.Proliferating cell nuclear antigen（PCNA）-binding protein C1orf124 is a regulator of translesion synthesis[J].The Journal of biological chemistry，2012，287（41）：34225-34233.

[20]Ducoux M，Urbach S，Baldacci G，et al.Mediation of proliferating cell nuclear antigen （PCNA）-dependent DNA replication through a conserved p21（Cip1）-like PCNA-binding motif present in the third subunit of human DNA polymerase delta[J].J Biol Chem，2001，276（52）：49258-49266.

[21]Hirota K，Yoshikiyo K，Guilbaud G，et al.The POLD3 subunit of DNA polymerase δ can promote translesion synthesis independently of DNA polymerase ξ[J].Nucleic acids research，2015，43（3）：1671-1683.

[22]Murga M，Lecona E，Kamileri I，et al.POLD3 is Haploinsufficient for DNA Replication in Mice[J].Molecular cell，2016，63（5）：877-883.

[23]Zhou Z，Wang L，Ge F，et al.Pold3 is required for genomic stability and telomere integrity in embryonic stem cells and meiosis[J].Nucleic acids research，2018，46（7）：3468-3486.

（收稿日期：2018-09-06修回日期：2018-10-16）

（編辑：潘明志）