TCT联合HPV,E6/E7,mRNA定量检测宫颈上皮内瘤变的临床应用价值

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【摘要】 目的：探讨利用HPV E6/E7 mRNA检测技术检测妇科子宫颈上皮内瘤变的临床应用价值。方法：对69例TCT检查结果为宫颈上皮内瘤变的患者，应用HPV E6/E7 mRNA检测技术对感染HPV病毒中的癌基因片段E6、E7转录子做出定量检测。结果：>ASC-H组E6/E7 mRNA转录阳性率、转录数分别为60.6%、（18 285.42±1487.71），均高于≤ASC-H组的33.3%、（2668.43±681.39），差异均有统计学意义（P<0.05）；宫颈细胞学检查为宫颈癌的HPV E6/E7 mRNA转录数明显高于其他类型，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：宫颈上皮内瘤变与E6/E7 mRNA转录具有相关性，即转录数与病变的进展程度及细胞的恶性转化密切相关，在宫颈癌筛查中检测HPV E6/E7 mRNA的转录具有潜在价值。

【关键词】 TCT； HPV E6/E7 mRNA定量检测； 宫颈上皮内瘤变

【Abstract】 Objective：To discuss the clinical application value of quantitative detection the HPV E6/E7 mRNA in cervical intraepithelial neoplasia.Method：In 69 cases of TCT examination results for cervical intraepithelial neoplasia，use of HPV E6/E7 mRNA detection technology for the infection of HPV virus in the cancer gene fragment E6，E7 transcription to make quantitative detection.Result：>ASC-H group HPV E6/ E7 mRNA transcription positive rate （60.6%） was higher than the≤ASC-H group （33.3%），>ASC-H group HPV E6/E7 mRNA transcription number （18 285.42±1487.71） was higher than the ≤ASC-H group （2668.43±681.39），the differences were statistically significant（P<0.05）.Cervical cytological examination for cervical cancer HPV E6/E7 mRNA transcription number was significantly higher than other types，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The cervical intraepithelial neoplasia is closely related to the E6/E7 mRNA transcription，that is，and that means the HPV E6/E7 mRNA transcription affect the the progression of lesions and malignant transformation of cells，quantitative detection the HPV E6/E7 mRNA has potential clinical application value in the screening of cervical intraepithelial neoplasia.

【Key words】 TCT； Quantitative detection of HPV E6/E7 mRNA； Cervical intraepithelial neoplasias

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College to Inner Mongolia University of Science & Technology，Baotou 014010，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.029

研究認为单一的宫颈细胞学检查不论是传统的巴氏涂片还是薄层液基细胞学检查（TCT）对于宫颈癌前病变和宫颈癌筛查的敏感性均较低[1]。目前研究已证实，人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌发生的主要危险因素，其中高危型的HPV病毒持续性感染可导致宫颈癌及癌前病变，HPV E6/E7是病毒癌基因转录产物，其表达可导致宿主细胞的恶性转化[2]，但在大部分HPV感染的病例中病毒会自动清除，只有少部分会发展成为对上皮细胞的高度损伤[3]。目前文献[4]研究表明，宫颈细胞的病变程度不单与病毒类型以及负荷量相关，更和病毒的活动程度关系紧密。而病毒癌基因组E6/E7的转录子mRNA作为病毒活动程度的指标，其定量检测具有非常重要的临床辅助诊断价值。有研究建议采用HR-HPV E6/E7 mRNA检测对ASC-US进行分流[5]。本研究为来自包头医学院第一附属医院妇科就诊并同时行TCT检查及HPV E6/E7 mRNA定量检测854例患者，并对TCT检查结果为宫颈上皮内瘤变的69例患者的HPV E6/E7 mRNA定量检测结果进行回顾性分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年6月-2016年6月就诊于本院妇科门诊、住院的854患者，年龄18～77岁，临床表现多为轻或重度宫颈炎症、宫颈糜烂、不明原因的阴道流血、性交出血，并排除妊娠，取材前3 d内无性生活史。所有研究对象已经伦理学委员会批准，患者均知情同意。

1.2 主要仪器与试剂 QuantiVirusTM诊断试剂盒原材料、QuantiVirusTM冷光仪均由美国Diaca-rtaLLC公司总部提供。

1.3 方法

1.3.1 标本采集及处理 采用专用宫颈细胞刷收集子宫颈和宫颈鳞柱交界处的脱落细胞，将颈管细胞采集刷伸入阴道并抵住宫颈，其前面的刷毛伸入到宫颈管内，按顺/逆时针方向转动宫颈刷5圈，并立即将其收集到的细胞保存在专用保存液的瓶子中。

1.3.2 分组 本研究按照宫颈细胞学TBS分类法，将宫颈上皮内瘤变分为两组：第一组为>ASC-H组：包括鳞状细胞癌（SCC）、腺癌（AC）、高度鳞状细胞上皮内病变（HSIL）、低度鳞状细胞上皮内病变（LSIL）；第二组为≤ASC-H组：包括意义不明不典型鳞状细胞（ASC-US）、不能除外高度不典型鳞状上皮细胞（ASC-H）。

1.3.3 HPV E6/E7 mRNA定量检测 HPV E6/E7 mRNA定量检测使用专利的bDNA技术，利用专利的探针设计捕获待测目标，再经过杂交信号放大即可定量检测病毒，最终通过添加底物产生化学发光，以此对待测核酸即HPV病毒中的癌基因片段E6、E7转录子做出定量检测，通过转录数值来判断HPV病毒与上皮细胞整合的情况，从而判断宫颈癌及癌前病变发生的可能性。转录数大于1000为HPV E6/E7 mRNA定量检测阳性，转录数1000～4000为低度危险值；4000～10000为中度危险值；>10000为高度危险值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCT诊断宫颈上皮内瘤变细胞学及

HPV E6/E7 mRNA检测结果 854例患者中，TCT检查结果为宫颈上皮内瘤变的患者有69例，其中36例≤ASC-H组中HPV E6/E7 mRNA转录阳性者12例，转录阳性率为33.3%；而33例>ASC-H组中HPV E6/E7 mRNA转录阳性者20例，转录阳性率为60.6%，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 不同宫颈上皮内瘤变细胞学平均的HPV E6/E7 mRNA转录数值 >ASC-H组E6/E7 mRNA转录数为（18 285.42±1487.71），高于≤ASC-H组的（2668.43±681.39），差异有统计学意义（P<0.05）；ASC的HPV E6/E7 mRNA转录数为（2668.43±681.39），LSIT为（8416.81±875.62），HSIL为（7129.73±724.38），Ca为（39 309.72±3471.55），宫颈癌的HPV E6/E7 mRNA转录数与其他比较明显偏高，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

宫颈癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，HPV感染是宫颈癌发生的主要危险因素。几乎100%的高级别CIN以及宫颈癌都合并HPV感染[6]。目前研究表明，宫颈癌是唯一一种经过医学干预能使发病率和死亡率下降的恶性肿瘤，而预防和控制的关键是通过筛查早期发现和治疗癌前病变。将液基薄层细胞检测系统（TCT）检查作为主要手段应用于宫颈癌筛查以来，已使宫颈癌的发生率和死亡率明显下降[7]。ASC的诊断标准为细胞出现比单纯反应性改变更加显著的异常特征，但未达到诊断鳞状上皮内病变的程度，其可能提示慢性子宫颈炎、CIN，甚至是宫颈癌[8-9]。故应十分重视和加强对ASC患者及时、有效地评价和管理，防止宫颈浸润癌的发生。2012年美国阴道镜和病理学会提出对于ASC的最佳方案为反馈性HPV检测，阳性者行阴道镜检查[10]。

本研究则以TCT联合目前最先进的HPV E6/E7 mRNA定量检测对ASC-US及以上病例进行统计分析，既可以使高度病变得到比较及时的诊治，避免漏诊，又可以减少临床负担。目前用于检测HPV E6/E7 mRNA水平的方法有核酸序列扩增法和支链DNA信号放大技术，部分市售的试剂检测HR-HPVl6、18、31、33、45中E6/E7 mRNA的转录[11]，而本研究所用试剂可检测14种HR-HPV mRNA，故敏感性更高。

病毒癌基因蛋白E6/E7是细胞惡性转化的主要原因，一旦HPV整合入人的基因组，E6/E7 mRNA的表达将不受限制，其增加到一个引起恶性转化的水平，检测这种致癌基因的转录具有不必重复进行检测即能鉴定高危反复感染者的潜力[12]，在宫颈疾病早期的检测中具有潜在的价值。

本研究利用QuantiVirusTM检测法检测

69例宫颈上皮内瘤变患者的病毒活动程度指标HPV E6/E7 mRNA的转录子，发现>ASC-H组E6/E7 mRNA转录阳性率、转录数分别为60.6%、（18 285.42±1487.71），均高于≤ASC-H组的33.3%、（2668.43±681.39），差异均有统计学意义（P<0.05）；宫颈癌的HPV E6/E7 mRNA转录数高于其他，差异有统计学意义（P<0.05）。

结果表明，宫颈高度病变与E6/E7 mRNA转录具有相关性，即HPV E6/E7 mRNA的转录与病变的进展程度及细胞的恶性转化密切相关，这与刘桐宇等[13]的研究，随着细胞学级别增高，E6/E7 mRNA表达相应增加，不同细胞学分组间mRNA拷贝值差异有统计学意义；与黄宝英等[14]的高危HPV E6/E7 mRNA可以应用于宫颈癌筛查，在筛查中联合HPV E6/E7 mRNA及细胞学检测有利于提高诊断准确性的结论相一致；也与潘嫱微等[15-16]HPV E6/E7 mRNA检测可作为ASC-US患者分流的一种新方法，具有更高的特异性和效能的观点一致。此外，从本研究结果中可以看出，在≤ASC-H组中也有HPV E6/E7 mRNA转录阳性的患者，这应当引起临床的重视，他们可能是一些潜在的宫颈癌高危患者，而这有待于进一步随访研究。

总之，这种以专利的bDNA技术为基础的HPV E6/E7 mRNA的定量检测通过对HPV E6/E7转录值的升降来判断宫颈癌及癌前病变发生的可能性，具有很好的重复性和自动化前景，王华等[17]也有类似结论，并认为E6/E7 mRNA更适用于宫颈癌发病风险的评估。HPV E6/E7 mRNA的定量检测为宫颈癌筛查提供了另一条有意义的途径，其结果有利于宫颈癌的早期诊断、控制发展及预后监测。

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（收稿日期：2016-08-18） （本文编辑：张爽）