疼痛实验动物模型的探讨

【摘要】 总结近年来国内外广泛应用或新近建立的动物疼痛模型，提出对今后疼痛模型发展的认识。在模型建立的方法上，要创制接近临床实际的中西医证病结合模型；在有关疼痛指标的检测方面，要以观察疼痛模型的行为反应和反射活动为主转向以高科技手段定性、定量为主。

【关键词】疼痛；模型；实验动物

疼痛是个复杂的神经病理与主观感受症状，产生的原因多种多样，近年来，在疼痛和镇痛研究领域已普遍重视建立模拟临床患者急、慢性或持续性疼痛的实验模型。疼痛模型建立的方法可以多种多样，一般地，有化学刺激性模型，物理刺激性模型，神经源性损伤模型，内脏牵拉疼痛模型以及其他多种模型。但要一个模型同时反映多种病因引起的疼痛是相当困难的，实验者需针对研究的目的去选择或建立实用的疼痛模型。现就近年来国内外广泛应用或新近建立的疼痛模型作一简要探讨。

1 化学刺激法

化学刺激法制造的疼痛模型是目前研究最多、应用最广泛的的一类疼痛模型，主要有炎性刺激致痛和药物刺激致痛两种。

1．1 炎性刺激致痛

1．1．1 炎剂内脏痛模型

1．1．1．1 炎剂扭体法^[1] 常用小鼠，腹腔注射0．6%冰乙酸0．2 ml/只或0．05%酒石酸锑钾0．2 ml/只致痛。观察10~20 min 扭体反应的次数或出现扭体反应的动物数，计算镇痛百分率。本法适于筛选非麻醉性镇痛药，尤其是筛选甾体抗炎药镇痛作用的一种敏感而简便的一种方法，但缺乏特异性，个体差异大，故腹腔时的部位和操作技术应尽量保持一致。

1．1．1．2 蜂毒致结肠炎疼痛模型^[2] 在目视条件下将蜜蜂毒注入即时麻醉大鼠的乙状结肠黏膜下，在一定时间范围内观察清醒大鼠由于坛性内脏痛所致的紧张性疼痛行为，如舔咬下腹部及阴部区域，腹部收缩，身体伸展及全身收缩。此法避免了由于腹腔注射化学刺激物造成的腹壁躯体性痛成分的介入以及大面积的弥散性脏器、黏膜以及腹腔壁层的损伤，具有行为反应特征明显、痛评分客观实际、符合临床症状、操作简便且重现性好之优点，与福尔马林致痛相对照，前者比后者第二相炎症反应明显且持续期长，这对炎症性镇痛药的研究是至关重要的。

1．1．2 致炎剂致局部关节肿胀疼痛模型 方法是选用适当的致炎剂，于大鼠或小鼠后足跖或踝部皮下注射。如注入后0．5~1 h肿胀达峰值的鸡蛋清、5-HT、组织胺、缓激肽、右旋糖酐等短效致炎剂，或在注入后2~4 h肿胀达峰值的福尔马林（50 μl 4%）、交叉菜胶（0．1 ml0．5%）、琼脂、白陶土、酵母等中效致炎剂；甲醛（0．2 mg/50 μl）、氮芥、结晶尿酸钠在注入24 h后才达到峰值，持续约两周，消退也晚，为长效致炎剂。注入以后造成关节或足跖肿胀，测定足跖容积或关节周长。

1．1．3 佐剂关节炎模型^[3] 其基本方法是在大鼠尾根部皮内或足跖部注射福氏完全佐剂,注射后原发病变为致炎局部的炎症反应， 致炎后8 h炎症局部即出现红肿疼痛，18 h可达高峰，持续6 d左右，以后逐渐减退，持续数周、继发病变一般于致炎后10 d左右出现，表现为全身多发性关节损害。此模型与人的类风湿性关节炎很相似，其造模特异性高，假阳性率低,被认为是慢性痛最为理想的模型之一。

1．1．4 钾离子皮下透入或注射致炎性疼痛模型^[1] 常用动物为兔与大鼠，饱和KCl溶液，经一定强度的直流电透入或直接注射进入动物的不同皮下部位，引起疼痛。一般以引起上述疼痛反应的电流强度（mA值）作为痛阈。该模型主要用于药物或针刺在外周的镇痛机制。

1．1．5 辣椒素静脉推注致偏头疼模型^[4] 李树壮等用辣椒素静脉刺激和电刺激的方法，造成大鼠硬脑膜内血浆蛋白渗出，建立神经源性炎症动物偏头痛模型。

1．2 药物刺激致痛模型

1．2．1 硝酸甘油注射致偏头疼模型^[5]大鼠，皮下注射硝酸甘油10 mg/kg，造模后动物出现双耳发红、前肢频繁挠头、活动增多等表现。可能机理为，硝酸甘油在体内生成NO，NO通过强烈的扩张脑血管作用，造成无菌性眼炎症；另一方面NO具有神经毒性作用，可激发三叉神经的血管反射，诱发实验性偏头疼，该模型具有经济、简便、相似性好，实用性强等特点，已被广泛用在偏头疼的研究领域。

1．2．2 利血平化低5-HT伴局部脑血管痉挛头痛模型^[6]方法 小鼠，皮下注射利血平10 mg/kg，共14 d。于第14天将小鼠乙醚麻醉，大脑皮层注射血凝块2 μl/只。机理为单胺类神经递质耗竭剂利血平能够诱发偏头疼，又局部注射血凝块可以诱发脑血管痉挛。造模后，小鼠凝血时间明显缩短，痛阈值降低，全血及脑内5-HT含量明显下降，这些基本上反映了偏头疼的特点。

1．2．3 组胺、利血平与m-CPP［1-（3-氯苯基）］哌嗪头痛模型^[7]Olesen用连续给予组胺、利血平与m-CPP作为另一个实验性头痛模型，提示其中组胺作用最为明显，它通过扩张血管作用的H₁受体,并涉及NO通道而发挥作用。

2 物理刺激法

2．1 热刺激法

2．1．1 热板法^[1] 选用雌性小鼠,用热板测痛仪测量每鼠的痛阈（即痛反应情况潜伏期,指小鼠触热板至舔后足的时间）。对照组的痛阈按100%计算，求出给药组的痛阈提高率。本法对组织损伤最小，动物可反复利用，且简便易行，但对甾体类抗炎药不太敏感。

2．1．2 辐射热刺激甩尾法^[1] 小鼠或大鼠，用全反射式电影放映灯泡发出光来，聚集照射，以启动光源至鼠尾急速摆动的时间为甩尾潜伏期测痛阈，计算痛阈提高百分率。该法装置简单，操作方便，反应恒定、灵敏，能准确测出阈值及刺激强度。实用于麻醉性及非麻醉性阵痛药物的筛选,是纯粹的脊髓反射。

2．2．3 其他热刺激法 采用一定功率之辐射热，从下向上照射动物之脚底测定其回缩潜伏期，或采用后脚浸泡方法测试一定温度下后脚回缩潜伏期^[8]；或采用后脚浸泡方法测试一定温度下后脚回缩潜伏期^[9]；也有采用不同温度的热探头刺激以观测后脚回缩阈值^[10].

2．2 冷刺激法-冷板法 将动物置于保持在1℃~5℃金属板上,观测动物在一定时间内后脚收缩的次数及后脚保持在空中的时间,以衡量动物对冷刺激的敏感性^[11];carlton将后脚插入不同温度冷水中以观测后脚的回缩潜伏期 ^[10];最近也有应用丙酮及氯仿进行冷刺激的方法^[12].

2．3 电刺激法

2．3．1 电刺激-嘶叫法^[1] 常用小鼠尾刺激和家兔齿髓刺激的方法(以方波脉冲电刺激致痛),动物因疼痛可出现嘶叫反应,以嘶叫反应为疼痛指标,观察镇痛作用,该方法简便易行,疼痛反应指标明确,重现性好,方法可靠,但个体差异较大。

2．3．2 电刺激三叉神经偏头疼模型 麻醉大鼠,沿正中线切开皮肤,暴露颅骨,从前卤向后3．7 mm,矢状缝旁开2．9~3．1 mm处,左右各钻一直径2 mm的小空,下置不锈钢电极,经股静脉插管,深度为颅骨下9．2~9．7 mm,给于右侧神经电刺激(1．2 mA,5 Hz),持续5 min。一次性给予I标记人血清白蛋白(125I-HAS),结果电刺增加了刺激侧硬脑膜内125I-HAS的渗出；刺激侧血浆蛋白的渗出量随刺激后时间的延长而逐渐减少，而非刺激侧I-HAS的渗出水平直到刺激后180 min未发生明显波动^[13]此模型造成大鼠硬脑膜内血浆蛋白渗出，是一成功的神经源性动物疼痛模型。

2．4 机械性痛觉过敏模型 一般可用软毛刷或铅笔头轻触动物的皮毛以测试动物对轻触觉刺激的反应，目前较常用的方法为应用系列的Vonfry针丝压迫皮肤以产生不同程度的压力。可用这种针丝按从小到达的顺序刺激动物脚底记录缩退之痛阈值（机械刺激回缩阈值），或以一定压力的Vonfry针丝以一定频率的反复刺激测试其后腿收缩频率^[13]，动物对这些刺激常表现为缩脚、逃跑、嘶叫及攻击性行为。

3 神经源性损伤模型

3．1 神经瘤模型^[14] 是20世纪70年代，由Wall及其同事首先介绍的神经病理疼痛模型。方法是：大鼠，麻醉，于一侧后肢大腿外侧切开皮肤，分离肌肉，暴露坐骨神经干，在大腿中断，用细细线紧扎神经干，然后在结扎的远断完全切开神经干，再将断面的近中断神经干5~8 mm植入一端密闭的医用聚乙烯管内，最后缝合皮肤。通常在术后9~40 d，切断的轴突形成神经瘤，并长出枝芽。该模型主要模拟临床截肢后的幻肢痛和神经全切断以后的症状。动物常表现为“自残”（self-intilate）现象，尽管不知道自残是否与进行性病理疼痛有关，但这一模型已被广泛用于外周神经病理机制的研究，并取得了长足的进展。

3．2 背根节慢性压迫实验模型 (CCD)^[15] 麻醉大鼠,于背部正中L4~L₆部位切开皮肤,分离脊椎一侧肌肉,用L型探针头按一定方向插入L₅椎间孔约4 mm,然后抽出针头再将不锈钢针(长4 mm,直径0．5~0．8 mm)沿探针进入方向与途径插入L₅椎间孔。本模型的特点是受损的DRG神经元出现自发放电的频率较高,并呈现多种放电节律形式,这一神经元超兴奋的客观指标,为研究痛敏的细胞机制以及痛信号的起搏机制提供了有效的手段,该模型仍保留外周神经的传出与传入功能,与临床椎间孔狭窄和椎间盘突出等引起腰背痛和坐骨神经痛的情况相似。

3．3 慢性结扎损伤模型（CCI）^[16] 大鼠暴露坐骨神经干,作3~4个轻度结扎,间距1 mm,结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动为宜,动物于5~7 d开始出现自发痛、痛敏、痛觉异常等，因此类似临床的慢性疼痛症状，近年已成为应用最为广泛的神经病的疼痛模型。

3．4 段性脊神经结扎损伤模型^[17] 将大鼠L₅和/或L₆脊神经切断或结扎,可以造成坐骨神经的部分损伤,这种模型具有较明确的损伤定量和脊髓阶段定位,而且有利于研究受损与未受损神经纤维在疼痛机制中的作用。

3．5 外周神经冰冻损伤模型^[18] Deleo采用-60℃ 的冰冻探头直接接触坐骨神经干而造成坐骨神经冰冻损伤,该模型适用于研究暂时性外周神损伤引起的神经源性疼痛。

3．6 其他神经源性损伤模型^[19] 除以上模型外,还有多种通过不同损伤方法制备的神经病理疼痛模型。例如,切断一侧坐骨神经(1/3),引起双侧后肢痛敏;切断支配区的交感神经,可以消除异常疼痛反应;在一侧紧靠DRG的外周端,结扎1或2支腰部脊神经,可引起术侧后肢长达5~10周的疼痛反应,其优点是损伤与正常的脊神经完全分开,缺点是手术要切除L₅或L₆横突,波及范围较大。

4 内脏牵拉痛动物模型^[19,20]

目前国内以有不少内脏牵拉造成的疼痛模型,造模的方法有:用气囊扩张胃;用套塑料管的线绳拉胃;电刺激内脏大神经等。作为内脏牵拉反应的客观指标有:不同水平中枢的诱发电位,内脏大神经的反射性放电、肋间神经放电、动脉血压、食道运动、动物的胃肠外翻、挣扎、吼叫等。这些模型从不同角度给研究内脏疼痛积累了资料。

5 冠心病心绞痛模型

张页^[21]等采用食饵性动脉粥样硬化加“耳缘静脉放血”及垂体后叶素法，建立冠心病心绞痛气虚痰浊证的动物模型,从主动脉、冠状动脉、心肌病理形态学证实此法可应用于中医模型学；谭之生等^[22]用结扎犬左冠状动脉前降支，造成心肌缺血、心肌梗塞疼痛模型，观察舒冠滴丸对心绞痛的作用，证明该模型稳定可靠，符合临床实际。

6 结语

一个较为理想的疼痛模型应该满足下述基本要求：①致痛原因近似临床实际情况；②动物的疼痛行为反应以及逃避疼痛刺激的反射活动与某种或某些慢性疼痛症状相似，可以客观检测；③便于进行疼痛发生机制的研究；④模型制备简便，成功率高。目前，西医疼痛模型在其药理与病理研究中已相当成熟，但在新方法的建立，原有技术的完善以及新理论的形成上还存在差距，为了达到以上的基本要求和弥补不足，我们认为，疼痛的实验动物模型还应在以下几个方面进一步加强。

6．1 在疼痛模型建立的方法上，目前多采用单纯外界伤害性刺激的方法，尚不能全面反映疾病内在的实际情况，所以，首先应提倡建立接近临床实际的具体疾病模型或证病结合模型。例如，陈丁生等^[23]以50 mg/kg给予Wistar雄性大鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）造成实验性大鼠糖尿病模型，同时采用辐射热刺激法照射大鼠右足外踝部致使发生痛敏观察引起大鼠缩腿反应的潜伏期，以研究中药渴痹康对防治糖尿病神经病变的影响，观察到STZ诱导的糖尿病大鼠模型有着与临床完全一致的多饮、多食、多尿、形体消瘦“三多一少”症状，值得参考。其次，要重视理解疾病的起因,病理机制及发展过程,使要建立的动物模型与某一疾病发生的病因、病理过程相吻合、把造模成功与否的标准由原有的表象、直观、整体观改变为因果分析方法，系统整体观。最后，要加强与临床研究进行合作，弄清某一疾病出现疼痛症状的根本生理与病理机制，为疼痛实验动物模型的建立提供理论基础和实验依据。

6．2 在动物学上，随着医学模式的改变，疼痛模型的建立要求动物与人必须完全相似，即必须采用自然病因，且把疼痛的病因与病性、病位、环境、年龄、体质等因素综合在一起考虑，这就要求实验动物学重视人与动物的相似形研究，注意动物的个体差异研究，注意不同疼痛动物的行为研究。另外，在大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、狗等袭用的动物之外，是否还具有更具特色的或便于疼痛机制研究的受试对象可供选择，必要时还应与兽医学联合进行研究。

6．3 在指标的选择和检测上，对于疼痛与镇痛机理的分析以前常以模型动物的行为反应和逃避疼痛刺激的反射活动为依据，虽然能说明一定的问题，但主观因素多，个体差异大，结果分析粗浅，已远远不符合时代发展的要求。因此，现代对于疼痛相关指标的检测分析就急需引入高科技的手段和技术（如膜片钳技术、色谱技术、计算机分析技术、免疫组化和原位杂交等技术）进行定性和定量；在相关指标的选择上，重视与疼痛发生机制关系较为密切的单胺类神经递质、与神经通路密切相关的即刻早期基因（immediately early gene, IEG）以及与外周中枢不同水平的痛觉调制中起重要作用的NO及NOS等，使疼痛这种本来模糊的主观感觉定性定量。

6．4 在模型的实用性和可操作性上，则要求模型制备方法简便，程序简单，一次性造模成功率高，尽量避免对模型无关的创伤和损害，模型应具重现性和一致性，而且要便于进行疼痛发生机制的研究。

6．5 目前，科研中使用较多的为西医病理疼痛模型，却忽视了中医对于疼痛病症的认识或缺少中西医疼痛模型之间的对比研究。应根据中医对疼痛“不通则痛”和“不荣则痛”病理机制的认识，建立符合中医理论的中医“证候”疼痛模型或中西医病症结合模型，这将有利于全面深入的揭示痛与镇痛的机理，有利于探讨疼痛这种症候在某一具体疾病中的体现，同时对于发展中医对于疼痛生理病理机制认识的理论也具有重要意义。陈小野^[24]用醋酸给予大鼠胃底注射造成醋酸性胃溃疡疼痛病模型与破气耗气加饥饱失常造成大鼠脾虚证的中西医病证结合模型，为研究中医“脾胃虚寒疼痛”提供了科学的实验动物模型，同时也为建立符合临床实际的证病结合模型开创了道路，提供了思路。

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